伍燕，汪偉，王燕，申利群

（1.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州興義 562400）（2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西南寧 550006）

地處黔、滇、桂三省交界處的黔西南州盛產(chǎn)大型野生食用真菌，尤其安龍縣是野生牛肝菌的主產(chǎn)地，每年5 月到10 月，野生牛肝菌依次對應(yīng)三個節(jié)氣（端午節(jié)、中元節(jié)、中秋節(jié)）大量涌出。牛肝菌味道鮮美，在當?shù)貍涫軞g迎，其中白蔥牛肝菌和紅蔥牛肝菌以濃郁的菌香味和脆嫩的質(zhì)感在牛肝菌系列中價位較高，這兩種牛肝菌在大小、形態(tài)和顏色上相似，上市期間二者相伴相隨，普通人不易區(qū)分。兩種牛肝菌都能散發(fā)出蔥香味因而當?shù)厝诵蜗蟮胤Q它們?yōu)榘资[牛肝菌和紅蔥牛肝菌，其分類上的學(xué)名并不被人們熟知和了解，白蔥牛肝菌由Li 等[1]于2013 年定名為粉黃牛肝菌（Boletus roseoflavus），紅蔥牛肝菌由Wu 等[2]于2016年定名為蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），蘭茂牛肝菌因香味和口感較好，價位比粉黃牛肝菌高。

牛肝菌營養(yǎng)價值高，含有人體所需要的所有氨基酸種類，對其氨基酸組成尤其是對必需氨基酸進行分析并按標準分級，是評價其營養(yǎng)價值高低的重要手段，而對野生食用菌的營養(yǎng)進行分析、評價是食用菌研究的重點，研究結(jié)果可以指導(dǎo)野生食用菌的馴化和規(guī)模化生產(chǎn)，依據(jù)食品安全國家標準檢測樣品中各種營養(yǎng)成分含量，參照FAO/WHO 規(guī)定的人體必需氨基酸模式和雞蛋蛋白質(zhì)氨基酸模式進行比較，計算氨基酸評分（AAS）、化學(xué)評分（CS）和必需氨基酸指數(shù)（EAAI）[3]，可對食用菌進行化學(xué)分析營養(yǎng)評價。國內(nèi)文獻對白蔥牛肝菌和紅蔥牛肝菌的分子生物鑒定、營養(yǎng)成分分析及評價鮮有報道[4,5]，本研究對產(chǎn)自黔西南州的白蔥和紅蔥牛肝菌進行分子生物學(xué)鑒定并構(gòu)建進化樹，對比分析二者的主要營養(yǎng)成分、氨基酸、維生素和礦質(zhì)元素等含量，進行系統(tǒng)的分析和評價，旨在為地處黔、滇、桂三省交界處的牛肝菌真菌資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：白蔥牛肝菌、紅蔥牛肝菌新鮮子實體，7 月份購于興義豐源市場。

實驗試劑：三氯甲烷、Tris 平衡酚、無水乙醇、苯甲醇、一水檸檬酸鈉、二水檸檬酸鈉、常規(guī)分析純氨基酸等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

LA-8080 型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；Waters 2695 高效液相色譜儀，美國沃特世公司；FOSS全自動凱氏定氮分析儀，丹麥福斯公司；吉天原子熒光分光光度計，北京吉天儀器有限公司；Thermos i-cap Q 電感耦合離子體發(fā)射光譜儀，美國賽默飛公司；BILON-1000CT 超聲波提取器，上海比朗儀器制造有限公司；ETHOS-UP 微波消解儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；CP224S 型電子分析天平，德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和nLSU 鑒定

白蔥牛肝菌、紅蔥牛肝菌取菌蓋和菌柄無菌連接處，液氮研磨，CATB 法提取總 DNA[6]，引物LROR/LR5 擴增nLSU 序列[7]，電泳檢測后送上海生工測序。

1.3.2 子實體主要營養(yǎng)成分分析

新鮮白蔥牛肝菌和紅蔥牛肝菌子實體低溫保存（≤4℃），送廣西區(qū)分析測試中心，參照食品安全國家標準檢測樣品中各種營養(yǎng)成分含量。蛋白質(zhì)參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪參照GB 5009.5-2016《食品中脂肪的測定》；粗纖維參照GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》；粗多糖參照NY/T 1767-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》；可溶性多糖參照GB 5009.8-2016《食品中葡萄糖的測定》。

1.3.3 氨基酸分析

氨基酸測定按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》進行。氨基酸營養(yǎng)化學(xué)評價包括：氨基酸評分（AAS）、化學(xué)評分（CS）、必須氨基酸指數(shù)（EAAI）按文獻進行[8]。

其中An（mg/g 蛋白質(zhì)）（代表試驗蛋白質(zhì)中必須氨基酸的含量；Bn（mg/g 蛋白質(zhì)）代表標準蛋白質(zhì)（FAO 評分模式）中與相應(yīng)的必需氨基酸的含量；n 代表比較的必須氨基酸個數(shù)，n≤8。

1.3.4 礦質(zhì)元素分析

礦質(zhì)元素測定按照食品安全國家標準 GB 5009.268-2016《食品中多元素的測定》；GB 5009.93-2017《食品中硒的測定》和GB 5009.151-2003《食品中鍺的測定》進行。

1.3.5 維生素分析

新鮮牛肝菌子實體中維生素測定按照食品安全國家標準GB 5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測定》；GB 5009.84-2016《食品維生素B1的測定》；GB 5009.85-2016《食品中維生素 B2的測定》；GB 5009.82-2016《食品中維生素A、D、E 的測定》進行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

MEGA 6.06 和ClustalX 1.83 構(gòu)建白蔥和紅蔥牛肝菌進化樹，Excel 2019 進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實體分子生物學(xué)鑒定

參照相關(guān)文獻并結(jié)合實際可知[9]，粉黃牛肝菌通體黃色至硫磺色，子實體中等至較大，菌蓋扁半球形，直徑8～15 cm，菌肉肥厚，致密；菌柄圓柱形，基部膨大球狀，長6～12 cm，粗2.5～3 cm，菌肉白色，受損后局部僅有輕微色變，與特定林木（如柞、櫟等闊葉林及針闊混交林）共生，屬外生菌根菌。蘭茂牛肝菌通體為粉紅或緋紅色，全株散發(fā)一股濃烈的蔥香味，“紅蔥”由此得名，受損后傷變部位快速變藍黑色，故也稱“見手青”，菌蓋半圓形，寬7～16 cm，蓋肉厚；菌柄粗棒狀，長5～13 cm，肉質(zhì)堅脆，茶花黃色，傷后變藍，后轉(zhuǎn)污褐。圖1 為基于nLUS 序列比對結(jié)果，經(jīng)NBCI 上Blast N 比對其保守序列，俗名為白蔥（Baicong）的牛肝菌與粉黃牛肝菌Boletus roseoflavus（JX290190）有100%同源性，序列提交NCBI 后獲得基因號MW 567156；俗名為紅蔥（Hongcong）的牛肝菌與蘭茂牛肝菌Lanmaoa asiatica（MG030470）有100%同源性，序列提交 NCBI 后獲得基因號MW567155。

圖1 基于nLUS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree based on nLUS sequence

2.2 子實體的主要營養(yǎng)成分對比分析

為更好地了解在同類牛肝菌中興義產(chǎn)粉黃牛肝菌、蘭茂牛肝菌的營養(yǎng)價值，在文獻中找到三種已報道牛肝菌進行對比分析，分別是磚紅絨蓋牛肝菌[10]、橙黃疣柄牛肝菌[11]、灰褐牛肝菌[12]，從表1 可知，蘭茂牛肝菌的粗蛋白含量最高，達到56.0 g/100 g 干重，其次是白蔥牛肝菌46.20 g/100 g 干重，粗纖維含量在所列的文獻數(shù)據(jù)里最高，達到17.0 g/100 g 和15.0 g/100 g 干重，而粗脂肪含量較低，均是2.0 g/100 g 干重，在主要營養(yǎng)成分上，蘭茂牛肝菌明顯高于粉黃牛肝菌、磚紅絨蓋牛肝菌、橙黃疣柄牛肝菌和灰褐牛肝菌。

表1 粉黃牛肝菌、蘭茂牛肝菌與幾種牛肝菌中主要營養(yǎng)成分的比較（g/100 g）Table 1 Comparison of major nutrient components between Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica and several Boletus species

2.3 子實體中礦質(zhì)營養(yǎng)元素對比

表3 粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌中維生素含量比較（mg/100 g）Table 3 Comparison of vitamin content between Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica

粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌子實體中含有K、P、Fe、Mg、Zn、Se 和Ge 等多種人體所必需的礦質(zhì)元素，從表2 可知，所含礦質(zhì)元素中K 的含量較高，蘭茂牛肝菌和粉黃牛肝菌分別是3820、3190 mg/kg 干重，P、Fe、Mg 和Zn 的含量也較豐富，另外還有微量元素Se 和Ge，在礦質(zhì)元素營養(yǎng)上含量比較豐富。

表2 粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌中礦質(zhì)元素含量比較（mg/kg）Table 2 Comparison of mineral elements content between Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica

2.4 子實體中維生素含量對比

粉黃牛肝菌、蘭茂牛肝菌子實體所含維生素中，Vc 的含量分別是32.0 mg/100 g 和16.4 mg/100 g，也含少量維生素B2，和市售桃子（6.77 mg/100 g）、梨（11.07 mg/100 g）和蘋果（4.11 mg/100 g）的維生素C 含量相比較[13]，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的維生素C 含量高，抗氧化能力強，清除自由基的活性高。

2.5 子實體中氨基酸組成與含量對比

粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌子實體的必需氨基酸含量分別為11.27 g/100 g 和13.76 g/100 g 干重，含量比文獻報道的磚紅絨蓋牛肝菌（5.52 g/100 g）、橙黃疣柄牛肝菌（7.75 g/100 g）和灰褐牛肝菌（8.40 g/100 g）的高（見表4），同時，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的非必需氨基酸含量分別為16.50 和19.64 g/100 g，在所列文獻報道中總量最高，可見，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌是優(yōu)質(zhì)的氨基酸營養(yǎng)補充源。

表4 粉黃牛肝菌、蘭茂牛肝菌與幾種牛肝菌中氨基酸組成比較（g/100 g）Table 4 Comparison of aminoacids composition between Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica and several Boletus species

2.6 子實體蛋白質(zhì)中必須氨基酸含量評分

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值由必需氨基酸的種類、含量和所占比例決定[14,15]，將表4 中的必需氨基酸含量與粗蛋白含量比較轉(zhuǎn)換成Ax（某一必需氨基酸含量），Ax值與FAO/WHO 模式中相應(yīng)的氨基酸含量比較計算氨基酸評分（AAS），Ax 值與雞蛋評分模式中相應(yīng)氨基酸含量比較計算化學(xué)評分（CS），最終得出粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的必需氨基酸指數(shù)（EAAI）。從表5可知，除了亮氨酸AAS 值接近FAO 標準，其余必需氨基酸均達到標準，其中粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌中纈氨酸的含量遠超F(xiàn)AO 標準，纈氨酸能興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血糖平衡，具有保肝護肝功效。食物蛋白質(zhì)質(zhì)量評價常用EAAI 表示，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的EAAI 均>0.95，為優(yōu)質(zhì)食物蛋白源。

表5 粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的氨基酸評分及化學(xué)評分 Table 5 Amino acid scores and chemical scores of proteins in Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica

2.7 子實體中鮮味氨基酸組成

食用菌的鮮味主要由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸組成[16,17]，從表6 可知，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的四種鮮味氨基酸的含量均比磚紅絨蓋牛肝菌、橙黃疣柄牛肝菌和灰褐牛肝菌高，尤其是蘭茂牛肝菌，谷氨酸含量遠遠高于其他幾種牛肝菌，結(jié)合市場價位來看，蘭茂牛肝菌以鮮美的口感和特殊的香味深受消費者喜愛。

表6 粉黃牛肝菌、蘭茂牛肝菌及幾種牛肝菌中鮮味氨基酸含量比較（g/100 g）Table 6 Comparison of the content of flavor amino acids between Boletus roseoflavus and Lanmaoa asiatica and several Boletus species

3 結(jié)論

3.1 俗名為“白蔥”的牛肝菌在分類上屬粉黃牛肝菌Boletus roseoflavus，“紅蔥”在分類上屬蘭茂牛肝菌Lanmaoa asiatica，在基本營養(yǎng)成分中，二者粗蛋白含量高，分別占干重的46.20%和56.00%，比文獻報道的磚紅絨蓋牛肝菌（29.11%）、橙黃疣柄牛肝菌（21.17%）和灰褐牛肝菌（28.22%）高；粗纖維分別占干重的15%和17%，粗脂肪均占干重的2%，可溶性總糖分別占干重的9.6%和7.6%，可見，黔西南州所產(chǎn)的粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌是高蛋白、低脂肪、含豐富膳食纖維的野生牛肝菌。

3.2 粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌氨基酸含量高且種類齊全，氨基酸總量分別為27.77%和33.40%，磚紅絨蓋牛肝菌、橙黃疣柄牛肝菌和灰褐牛肝菌的氨基酸總量分別是15.47%、18.12%和21.96%，其中，纈氨酸含量較高（4.44%和5.20%），谷氨酸其次（3.60%和5.80%），而文獻來源的磚紅絨蓋牛肝菌、橙黃疣柄牛肝菌和灰褐牛肝菌的纈氨酸含量分別為0.80%、1.80%和1.20%，谷氨酸含量分別為2.64%、2.32%和3.08%。

3.3 粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）值分別為0.68 和0.70，超過FAO/WHO規(guī)定的0.6；必需氨基酸/總氨基酸E/(E+N)%值分別為40.58%和41.20%，達到FAO/WHO 要求優(yōu)質(zhì)E%應(yīng)達40%閾值；必須氨基酸值EAAI 均達1.33，超過FAO/WHO 規(guī)定值EAAI≥0.95 為優(yōu)質(zhì)蛋白源標準[18-20]。綜上所述，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌均是營養(yǎng)豐富的可推薦優(yōu)質(zhì)蛋白源，此外，粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量豐富，主要為K、P、Fe、Mg 和Zn，尤其是鉀的含量較高，分別達到3190 mg/kg和3820 mg/kg。粉黃牛肝菌和蘭茂牛肝菌的維生素C含量也較高，分別是32.00 mg/100 g和16.40 mg/100 g，是良好的真菌來源天然抗氧化劑。