張瞭飛，姜欣，李一澍，陳杉彬，李紅嬌，趙文梅,3，韓興林，孫金沅，王德良*，郝飛克*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)3(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧，530004)4(北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

酒是各種應(yīng)酬中必不可少的飲品，但長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)引起酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化等不同程度的肝損傷[1]。酒精性肝病受損的主要發(fā)病機(jī)制之一是氧化應(yīng)激[2]，酒精進(jìn)入機(jī)體被吸收并過(guò)量代謝，使肝細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基和代謝產(chǎn)物，影響肝臟正常的氧化還原反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化并損害細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而損害肝細(xì)胞的完整性和功能，破壞細(xì)胞器，降低細(xì)胞器的修復(fù)能力，最終導(dǎo)致肝損傷[3-6]。多酚類(lèi)化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，是一類(lèi)具有1個(gè)或多個(gè)酚羥基的化合物[7]。人體自身不能合成多酚類(lèi)化合物，因此需要從食物中攝取。研究表明多酚類(lèi)化合物不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用，還具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗感染、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇及預(yù)防心血管疾病等功能[8]。4-甲基愈創(chuàng)木酚是一種天然存在于咖啡、可可、啤酒、雪利酒、威士忌酒中的多酚類(lèi)化合物，具有辛香、藥香、丁香、香莢蘭香氣，多用于調(diào)配食用香精，也可用于威士忌的增香劑。近年來(lái)研究表明，在中國(guó)白酒中也可檢測(cè)到4-甲基愈創(chuàng)木酚[9]，并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化的生物活性[10]。有研究報(bào)道，其他多酚類(lèi)物質(zhì)，諸如茶多酚、姜黃素、槲皮素等對(duì)小鼠酒精性肝損傷有保護(hù)作用[11-13]，但尚未見(jiàn)4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用。本研究旨在通過(guò)4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)酒精性小鼠肝組織病理?yè)p傷的影響，觀察其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境

C57BL/6J小鼠(雄性，49～56日齡，體重18～22 g)，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2019—0010，飼養(yǎng)于(22±2) ℃、相對(duì)濕度(55±5)%的清潔級(jí)動(dòng)物房，合籠飼養(yǎng)，5只/籠，控制照明時(shí)間為每天12 h，自由進(jìn)食與飲水。實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理與保護(hù)相關(guān)規(guī)定，隨時(shí)接受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督與檢查。

1.2 藥品與試劑

4-甲基愈創(chuàng)木酚(分析純，純度>95%)，吉爾生化(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào) PC0020)，北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)測(cè)定試劑盒(COD-PAP法)(貨號(hào) A111-2-1)、甘油三酯(triglyceride，TG)測(cè)定試劑盒(GPO-PAP酶法)(貨號(hào) A110-2-1)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) A112-2-1)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) A113-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) C009-1-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) C010-1-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)A001-1-2)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) A006-1-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) A005-1-2)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A007-1-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(貨號(hào) A003-1-2),南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SpectraMax? iD3多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Micro 21R小型臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；2-16 N高速微量離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠肝損傷模型的建立與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

50只小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，分別為空白組，模型組，4-甲基愈創(chuàng)木酚低、中、高劑量組，每組10只。除空白組小鼠灌胃0.9%的生理鹽水，模型組灌胃50%食用酒精外，其余各組小鼠均進(jìn)行損傷和給藥處理，具體處理方式如表1所示，連續(xù)灌胃56 d。每周記錄小鼠體重變化，末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h后內(nèi)眥取血，麻醉處死小鼠。迅速取出肝臟并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)；同時(shí)取部分肝臟組織，4%中性甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學(xué)變化采用蘇木精-伊紅染色后觀察；其余肝臟于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)處理Table 1 Treatment of mice in each group

1.4.2 小鼠肝臟指數(shù)及肝功能檢測(cè)

末次給藥后，小鼠內(nèi)眥取血，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離得到血清。采用賴氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 小鼠血脂水平檢測(cè)(TC/TG/HDL-C/LDL-C)

采用COD-PAP法檢測(cè)血清中TC水平，采用GPO-PAP酶法檢測(cè)血清中TG水平，采用直接法檢測(cè)血清中HDL-C和LDL-C水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.4 小鼠肝臟中抗氧化酶活性和GSH含量的檢測(cè)

采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活力，采用鉬酸銨法測(cè)定CAT的活力，采用比色法測(cè)定GSH-Px活力、GSH含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.5 小鼠肝臟中過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的檢測(cè)

采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)測(cè)定MDA的含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.6 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

肝臟組織用4%中性多聚甲醛固定24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精溶液中脫水24 h，然后常規(guī)石蠟包埋后制作厚度約4～5 μm的切片。用二甲苯脫蠟制備好的切片，酒精梯度(95%、90%、80%、75%)脫水；蘇木精染色；鹽酸乙醇分化；0.5%伊紅染色；常規(guī)梯度酒精(75%、80%、90%、95%)脫水；經(jīng)100%酒精I(xiàn)(10 min)，100%酒精Ⅱ(10 min)；最后經(jīng)二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下，選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學(xué)變化。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 25.0分析處理數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為至少3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；圖表由Origin 2017繪制，P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)如表2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組的小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P<0.05)，但肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)明顯増加(P<0.05)。4-甲基愈創(chuàng)木酚干預(yù)可明顯降低小鼠的肝臟指數(shù)，與模型組相比，4-甲基愈創(chuàng)木酚各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)分別降低了7.3%(P<0.05)、12.7%和14.5%(P<0.05)。

表2 各組小鼠體質(zhì)量與肝臟指數(shù)Table 2 Body weight and liver index of mice in each group

2.2 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠肝臟功能的影響

如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平明顯升高 (P<0.05)，分別是空白組的1.15、1.25倍;與模型組比較，4-甲基愈創(chuàng)木酚低、中劑量組小鼠血清中的AST水平降低，但無(wú)顯著性差異，而高劑量組小鼠血清中AST水平降低了22% (P<0.05)；與模型組比較，4-甲基愈創(chuàng)木酚低劑量組小鼠血清中的ALT水平降低，但無(wú)顯著性差異，而中、高劑量組小鼠血清中ALT水平分別降低了17%和37%，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)。AST、ALT是臨床上常用的肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，它們水平的高低可以反應(yīng)肝細(xì)胞所受損傷程度的輕重，AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，ALT主要存在于肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)，肝細(xì)胞受損時(shí)，這2種酶可釋放到血液中，引起血液中肝功能酶學(xué)指標(biāo)異常升高[14-15]。肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，而代謝過(guò)程中的活性氧和有毒產(chǎn)物會(huì)破壞肝細(xì)胞膜和線粒體膜，導(dǎo)致這2種膜的通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT便釋放入血[16]。上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中AST、ALT水平均明顯升高，表明小鼠酒精性肝損傷模型建立成功。4-甲基愈創(chuàng)木酚高劑量組可明顯降低小鼠血清中AST的水平，4-甲基愈創(chuàng)木酚中、高劑量組可明顯降低小鼠血清中的ALT水平，表明4-甲基愈創(chuàng)木酚高劑量可有效保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體膜，維持肝功能正常。

圖1 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠血清中AST、ALT活性的影響Fig.1 Effect of 4-methyl guaiacol on serum AST,ALT activity in mice注：*代表與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；#代表與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠血脂水平的影響

如圖2所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯升高 (P<0.05)，分別是空白組的1.19、1.16、1.54倍，而HDL-C水平明顯下降(P<0.05)，比空白組降低了13.5%(P<0.05);與模型組比較，4-甲基愈創(chuàng)木酚低、中、高劑量組小鼠血清中TC水平分別降低了17.5%、20.1%和25.6% ；TG水平分別降低了14.9%、43.7%和63.1% ；LDL-C水平分別降低了57.4%、52.9%和18.3%；HDL-C水平分別升高了26.5%、30.9%和73.5%，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。脂質(zhì)代謝紊亂是酒精性肝損傷的另一重要表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)TG的沉積，同時(shí)酒精影響了肝臟脂質(zhì)代謝和血清脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致出現(xiàn)血脂水平異常[17]。LDL-C和HDL-C是在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)血脂的2種載脂蛋白，其中LDL-C的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性膽固醇，是將脂類(lèi)由肝臟向外周轉(zhuǎn)運(yùn)，HDL-C的功能是逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，是將脂類(lèi)由外周轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟分解代謝[18]。LDL-C增高則會(huì)引起血漿TC和TG增高，形成高血脂，酒精肝損傷會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，TC、TG代謝受到抑制，脂肪在肝細(xì)胞中過(guò)多沉積的同時(shí)，肝臟代償功能喪失，體內(nèi)存儲(chǔ)的大量脂肪被動(dòng)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致血清中TG水平明顯升高[19]。已有的研究表明，動(dòng)物攝入酒精后，血清中的TC、TG水平均升高，且血清LDL-C水平升高而HDL-C水平降低[20]。研究結(jié)果顯示，小鼠攝入酒精后可導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，血清的TC、TG和LDL-C水平升高，而血清HDL-C水平降低，4-甲基愈創(chuàng)木酚干預(yù)可明顯減輕酒精性肝損傷所致的血脂水平異常。

a-TC；b-TG；c-LDL-C；d-HDL-C圖2 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影響Fig.2 Effect of 4-methyl guaiacol on serum TC，TG，LDL-C,HDL-C content in mice

2.4 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠抗氧化酶活性和還原型谷胱甘肽含量的影響

由圖3可如，模型組小鼠肝臟組織勻漿中SOD、CAT、GSH、GSH-Px活力均下降，且與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明酒精誘導(dǎo)的氧化損傷降低了小鼠體內(nèi)SOD、CAT、GSH、GSH-Px的活力。4-甲基愈創(chuàng)木酚各劑量組小鼠肝臟組織勻漿中SOD活力均高于模型對(duì)照組，且低、中、高劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織勻漿中SOD活力與空白組比較，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明4-甲基愈創(chuàng)木酚起到維持肝臟中SOD活力穩(wěn)定的作用。4-甲基愈創(chuàng)木酚各劑量組小鼠肝臟組織勻漿中CAT活力均高于模型組，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織勻漿中CAT活力與空白組基本一致。GSH-Px、GSH活力均高于空白組和模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SOD、CAT、GSH、GSH-Px均屬正常機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，它們共同維持機(jī)體氧化平衡[21]。已有的研究表明，肝損傷會(huì)導(dǎo)致肝臟中的SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平降低[22]，本實(shí)驗(yàn)建立的酒精性肝損傷模型顯示與其基本一致。小鼠酒精灌胃后，4-甲基愈創(chuàng)木酚干預(yù)后，各劑量組肝臟中的SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平升高或與正常狀態(tài)保持一致，說(shuō)明4-甲基愈創(chuàng)木酚可提高機(jī)體抗氧化酶活性，改善酒精性肝損傷。

a-SOD；b-CAT；c-GSH-Px；d-GSH圖3 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性的影響Fig.3 Effect of 4-methyl guaiacol on SOD,CAT,GSH-Px,GSH activity in mouse liver

2.5 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠過(guò)氧化產(chǎn)物的影響

由圖4可知，模型組小鼠與空白對(duì)照組比較，肝組織中過(guò)氧化物指標(biāo)MDA升高，差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示酒精氧化損傷模型建立成功。4-甲基愈創(chuàng)木酚各劑量組小鼠與模型組比較，MDA濃度均有不同程度降低，均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的小分子產(chǎn)物之一，其含量的高低反映了細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，因此常被作為生物脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)。已有的研究表明，酒精性肝損傷小鼠肝臟中過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量大量增加，我們的研究與其基本一致，小鼠灌胃酒精后，在4-甲基愈創(chuàng)木酚的干預(yù)下肝臟中MDA含量明顯減少，說(shuō)明4-甲基愈創(chuàng)木酚可減輕肝臟由酒精導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[23]。

圖4 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠肝臟中MDA含量的影響Fig.4 Effect of 4-methyl guaiacol on MDA content in mouse liver

2.6 4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

如圖5所示，空白組顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)水腫現(xiàn)象及炎性細(xì)胞；模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列紊亂，大多數(shù)肝細(xì)胞呈水腫現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞纖維化，肝組織中有大小不一的脂肪滴空泡；4-甲基愈創(chuàng)木酚低、中劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列較整齊，肝細(xì)胞水腫現(xiàn)象、肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組有所減輕；4-甲基愈創(chuàng)木酚高劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊、大小均一，炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組顯著減輕。酒精性肝損傷的組織學(xué)特征主要包括肝細(xì)胞脂肪滴空泡的積累、脂肪肝 (脂肪變性和炎性細(xì)胞) 及肝硬化[24]。通過(guò)蘇木精-伊紅染色發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠的肝組織發(fā)現(xiàn)有大量炎性細(xì)胞和脂肪滴空泡，4-甲基愈創(chuàng)木酚給藥后此現(xiàn)象顯著減輕，說(shuō)明4-甲基愈創(chuàng)木酚可能對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。

a-空白組；b-模型組;c～e-4-甲基愈創(chuàng)木酚低、中、高劑量組圖5 各組小鼠肝組織病理形態(tài)Fig.5 Hepatic histological morphology of mice in each group

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用50%食用酒精對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，成功建立酒精性肝損傷的模型， 4-甲基愈創(chuàng)木酚給藥后小鼠血清中AST和ALT活性降低，小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px和 GSH 的活性明顯強(qiáng)于模型組，或與正常小鼠一致，MDA 水平低于模型組，說(shuō)明4-甲基愈創(chuàng)木酚可以保護(hù)肝臟中的抗氧化酶活性，并減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)肝臟，并減輕酒精性肝臟損傷。通過(guò)蘇木精-伊紅染色發(fā)現(xiàn)，4-甲基愈創(chuàng)木酚給藥后酒精性肝損傷病理特征顯著減輕。綜上所述，4-甲基愈創(chuàng)木酚對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，可以在一定程度上減輕酒精對(duì)肝臟所造成的損傷，其機(jī)制可能與增加肝組織抗氧化酶的活性、降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平有關(guān)。