汪祺，王曼虹，王亞丹，張樂帥，馬雙成*，文海若*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.蘇州大學，江蘇 蘇州 215123

雷公藤多苷片（TPT）由衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.根提取加工制成，具有抗炎和免疫抑制作用，臨床主要用于治療類風濕性關節(jié)炎[1]、腎病綜合征[2]、紅斑狼瘡、過敏性紫癜[3]等。其主要成分包括二萜類［雷公藤甲素（TP）］，三萜類［雷公藤紅素、雷公藤內酯甲（WA）］和生物堿類（雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤春堿、雷公藤對醌B）等。

現行國家藥品監(jiān)督管理局局頒標準（WS3-B-3350-98-2011）將雷公藤多苷片中的WA 列為含量測定項，規(guī)定含量值不得少于10 μg/片，將TP 列為檢查項，含量不得高于10 μg/片，而對其他成分未做明確規(guī)定[4]。研究表明，雷公藤多苷片中TP 是毒、效并存的成分，除具有一定肝、腎毒性外，可通過調控炎癥介質、活化T 淋巴細胞功能、調節(jié)細胞因子和類風濕因子表達、影響基質金屬類蛋白酶類和核轉錄因子-κB（NF-κB）表達水平等機制發(fā)揮抗炎作用。此外，雷公藤紅素也可通過調節(jié)NF-κB 和熱休克蛋白70 抑制非特異性免疫應答[5]。而雷公藤中其他成分，如多種生物堿的藥效作用目前研究較少。已有研究人員將不同生產企業(yè)生產的雷公藤多苷片進行了化學成分指紋圖譜與小鼠體內藥效學關聯，結果發(fā)現，成分的差異直接影響該制劑在小鼠體內的抗炎藥效[6]。因此，本研究以脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 為體外炎癥模型，并以一氧化氮（NO）分泌水平和分化抗原簇86（CD86）表達水平為指標，進一步明確雷公藤多苷片主要成分的藥效作用，為闡釋雷公藤多苷片的藥效物質基礎提供實驗依據，同時也將為科學合理地規(guī)范標準中有效成分的測定限度提供重要的數據支撐。

1 材料

1.1 細胞

RAW264.7 細胞購自中國科學院上海細胞庫，本研究所用細胞為第八代。

1.2 儀器與試藥

LPS（Sigma 公司）、TP（批號：111567-201404，純度：99.8%）、WA（批號：111597-200505，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；雷公藤紅素（批號：B20707，純度≥98%）、雷公藤春堿（批號：B20704，純度≥98%）；雷公藤次堿（批號：B20705）均購自上海源葉生物科技有限公司；雷公藤晉堿（批號：E-0715，純度≥98%）購自上海同田生物技術股份有限公司；雷公藤對醌B（純度＞98%，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所）。雷公藤多苷片（涉及生產企業(yè)：A、B、C、D、E、F、G，此處以字母代表；H為在G企業(yè)產品中人為在每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作為藥效學評價對照）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（BI 公司）；1%青鏈霉素混合液、NO 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）；磷酸緩沖液（PBS，Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司）；cell counting kit-8（cck-8，上海邁基生物科技有限公司）；PE-CD86 抗體（BD pharmingen公司）；利多卡因（Ark Pharm公司）；96 孔深孔板（上海泰坦科技股份有限公司）；96 孔未處理板（NEST 公司）；24 孔細胞培養(yǎng)板（Corning公司）。

NEO ALPHA 131120d 型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；ckx31SF 型倒置顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；2013-82090 型超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）；3111 型細胞培養(yǎng)箱、900 型超低溫冰箱［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；5427R 型高速冷凍離心機、5810R 型孔板離心機、Research plus 型移液器（德國艾本德有限公司）；ME204E/02型電子分析天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)（默克密理博生命科學有限公司）；DK-S22型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；2016C 型全溫金屬浴（海貍生物醫(yī)學工程有限公司）；FACS Verse型流式細胞儀（美國BD公司）；BCD-216TAM型冰箱（海爾集團）。

2 方法

2.1 細胞活力

處于對數生長期的RAW264.7細胞以3×105個/孔接種于24孔板，于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，給予不同質量濃度的單體（TP：2.5～160.0 ng·mL-1；雷公藤紅素：31.25～1 000.00 ng·mL-1；雷公藤對醌B：312.5～20 000.0 ng·mL-1；WA：62.5～4 000.0 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿均為312.5～20 000.0 ng·mL-1），來自不同企業(yè)的TPT（A～G）質量濃度為0～133.0 μg·mL-1，其中TP 及WA 含量見表1[7]。加樣后細胞于37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后每孔加入CCK-8 檢測試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h，并用酶標儀檢測各孔450 nm 處的吸光度值（A），根據公式（1）計算細胞存活率。

表1 不同企業(yè)TPT中TP質量濃度及作用于RAW 264.7細胞的IC50 μg·mL-1

參考半數抑制濃度（IC50）和細胞活性抑制結果，選擇IC50以上的濃度或最大無細胞毒性濃度為最高給藥濃度開展后續(xù)研究。

2.2 NO水平檢測

處于對數生長期的RAW264.7 細胞以3×105個/孔接種于24 孔板，每孔500 μL。細胞于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h 后，分為空白組（無細胞）、陰性對照組（有細胞但未加樣）、模型組LPS（0.1 μg·mL-1）組和LPS（0.1 μg·mL-1）組與不同質量濃度受試物共處理給藥組，每組6 個復孔，分別添加含受試物的培養(yǎng)液500 μL。TP 的質量濃度為2.5～40.0 ng·mL-1；雷公藤紅素質量濃度為62.5～1000.0 ng·mL-1；雷公藤對醌B 質量濃度為62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA質量濃度為250～4000 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿質量濃度均為1250～20 000 ng·mL-1，A～H 組TPT 的質量濃度均為4.16～66.50 μg·mL-1。加樣后細胞于37 ℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后每樣取50 μL 上清液添加于96 孔板，使用NO 檢測試劑盒檢測。每孔各添加試劑150 μL和試劑250 μL后混合均勻，使用酶標儀檢測各孔540 nm 處的吸光度值。試驗平行使用不同濃度的標準品（試劑盒提供）繪制標準曲線，用于計算NO水平。

2.3 CD86檢測

細胞接種和分組同2.2 項下。TP 的質量濃度為2.5～40.0ng·mL-1；雷公藤紅素為62.5～1000.0ng·mL-1；雷公藤對醌B 62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA 250～4000 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿均為1250～20 000 ng·mL-1，C 和D 組的TPT 的質量濃度為4.16～16.63 μg·mL-1，其余各組和H 組TPT 質量濃度均為4.16～33.25 μg·mL-1。加樣后細胞于37 ℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后除去上清液，加入PBS 200 μL 重懸并轉移至4 ℃水浴中的96 孔板，在4 ℃條件下1000 r·min-1離心5 min（離心半徑為13.5 cm）。移除上清，每樣添加稀釋后的PE-CD86 抗體（1∶100，PBS）50 μL 后重懸，并于4 ℃孵育20 min（10 min 左右振蕩1 次）。之后添加PBS200 μL 并于4 ℃條件下1000 r·min-1離心5 min（離心半徑為13.5 cm）。移除上清液，再次添加PBS200 μL后重懸細胞備用。使用流式細胞儀檢測藻紅蛋白（PE）熒光強度，從而反映細胞CD86表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 不同企業(yè)TPT 和雷公藤主要單體成分對RAW264.7細胞活性的影響

質量濃度為0.52～133.00 μg·mL-1的TPT 與RAW264.7細胞作用24 h后，以CCK-8法檢測細胞活力，其所含TP及WA質量濃度（以66.67 mg·mL-1TPT為 計）及IC50見 圖1、表1。各企業(yè)TPT 對RAW264.7 細胞的IC50排序分別為C＜B＜F＜A＜H＜D＜E＜G。值得注意的是，G 企業(yè)的TPT 不含TP，H 是人為在G 企業(yè)每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1的對照組，前者IC50約為后者的77倍；而IC50最低的C 企業(yè)TPT 中TP 的含量為各家最低。上述結果表明，TP 含量是影響細胞活力的主要成分之一。但TP含量高低并不完全反映TPT對細胞活力抑制的強弱，TPT 中其他成分可能也對細胞活力有抑制作用。

圖1 不同企業(yè)TPT對RAW264.7細胞活性的影響（,n=3）

給藥24 h 后，不同質量濃度的單體成分對RAW264.7 細胞活力的影響見圖2，TP 對細胞活性的抑制作用最強（IC50為26.11 ng·mL-1），其次為雷公藤紅素（IC50為618.6 ng·mL-1）、雷公藤對醌B（IC50為8649 ng·mL-1），其余單體成分在質量濃度高達20 μg·mL-1時 對RAW 264.7 細胞活力無影響。

圖2 不同雷公藤單體成分對RAW264.7細胞活性的影響（,n=3）

3.2 TPT 中主要單體成分及不同企業(yè)TPT 對RAW264.7細胞NO水平的影響

空白和陰性對照組細胞上清液中只檢出極低含量的NO，而LPS（0.1 μg·mL-1）與RAW264.7 細胞作用24 h后，可生成大量NO（＞10 μmol·L-1；P＜0.001）。

實驗發(fā)現，所有企業(yè)TPT 均可抑制LPS 誘導的NO水平升高（E企業(yè)起效質量濃度為8.31 μg·mL-1，其他企業(yè)均為4.16 μg·mL-1）。其中，企業(yè)A、C 中TPT 在質量濃度為8.31 μg·mL-1時，企業(yè)B、D、E、F 及H 在TPT 質量濃度為16.63 μg·mL-1時可將NO 水平抑制至接近空白對照組水平。G 企業(yè)TPT不含TP，對LPS 誘導的NO 水平的抑制作用最弱（圖3）。

圖3 不同企業(yè)TPT對NO水平的影響（,n=6）

TPT 中主要單體成分雷公藤紅素、雷公藤對醌B 分別自62.5、625.0 ng·mL-1起，對LPS 誘 導的NO生成水平產生抑制作用，該變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），且隨單體質量濃度增加抑制效應更加明顯；此外，TP 質量濃度為40 ng·mL-1時也可抑制LPS 誘導的NO 水平升高（P＜0.001，圖4）。其余單體成分在當前給藥濃度范圍內對LPS 誘導的NO水平升高無影響。表明現行質量標準中含量測定項WA 單體并無明顯抗炎活性，活性較強的成分為雷公藤紅素及雷公藤對醌B。

圖4 TPT主要單體成分對NO水平的影響（,n=6）

3.3 TPT 中主要單體成分及不同企業(yè)TPT 對CD86表達水平的影響

使用流式細胞術檢測不同受試物對RAW264.7細胞表面標志物CD86 的影響，并以平均熒光強度（MFI）作為評價指標?？瞻缀完幮詫φ战M的背景熒光強度較低，RAW264.7細胞經LPS（0.1 μg·mL-1）刺激后，細胞表面CD86 的表達量顯著增加（MFI＞500，P＜0.001）。不同企業(yè)制劑中（圖5），除G 企業(yè)外，其他企業(yè)和H 組的TPT 均可抑制LPS 誘導的CD86 表達水平升高（F 企業(yè)TPT 起效質量濃度為8.31 μg·mL-1，A～E 企業(yè)和H 組的TPT 起效質量濃度均為4.16 μg·mL-1）。受試物對CD86 的影響與其對NO 水平的影響趨勢基本相符。TP、雷公藤紅素和雷公藤對醌B 分別在質量濃度分別為5000、10 000、20 000 ng·mL-1時可抑制LPS 誘導的CD86增加，且變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。其他單體成分在當前給藥濃度范圍內未能抑制對LPS誘導的CD86表達量升高。表明現行質量標準中含量測定項WA 單體并無明顯免疫抑制活性作用，活性較強的成分為TP、雷公藤紅素及雷公藤對醌B。

圖5 不同企業(yè)TPT對CD86表達水平的影響（,n=6）

圖6 TPT主要單體成分對CD86表達水平影響（,n=6）

4 討論

炎癥反應是機體對外源性或內源性刺激的一種防御性反應，參與關節(jié)炎、腎損傷、自身免疫疾病等多種病理過程。其中NO 是炎癥級聯反應中的關鍵關節(jié)，抑制其過度表達，可有效緩解炎癥癥狀[8]。本研究所用的RAW264.7 細胞經LPS、γ-干擾素（IFN-γ）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）激活后轉化為M1型巨噬細胞，后者可產生一系列炎癥反應，包括分泌大量白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-12、IL-18，CD80、CD86共刺激因子呈高表達，以及激活誘導型一氧化氮合酶（NOS2或iNOS）產生NO。

研究結果發(fā)現，TP、雷公藤紅素和雷公藤對醌B 均對RAW264.7 細胞的活力有一定影響，抑制LPS 誘導的NO 和CD86 水平增加，提示三者為雷公藤多苷片中主要抗炎成分。TP 可抑制TNF-α刺激引起的環(huán)氧化酶-2（COX-2）和iNOS 的表達，并誘導前列腺素E2（PGE2）和NO 大量合成[9]。TP 在低濃度作用下可通過調控半胱天冬酶活性來抑制類風濕化膜細胞活性[10]，從而減少滑膜成纖維的過度增生，發(fā)揮治療類風濕性關節(jié)炎的作用。雷公藤紅素也參與多種炎癥信號通路的調控，如阻斷細胞核因子κB抑制物激活酶（IκB）的活性，抑制NF-κB 的活化及其核轉位，調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等[11]。關于雷公藤對醌B 的藥效作用的報道較少，Takaishi 等[12]研究發(fā)現雷公藤對醌B 是IL-1 抑制劑，有抗炎和調節(jié)免疫的作用，但具體的作用通路尚不明確，本結果與文獻報道基本一致，進一步驗證了雷公藤對醌B 的體外抗炎作用。值得注意的是，當前TPT的質量控制成分WA未表現出抗炎作用。

通過比較不同企業(yè)TPT 發(fā)現，所有TPT 均可拮抗LPS 誘導的炎癥效應。TPT 中TP 含量為影響RAW264.7 細胞活力，并拮抗LPS 誘導的NO 和CD86 水平升高的主要因素之一。但TP 含量最低的C 企業(yè)TPT 也可在較低濃度對上述炎癥指標產生抑制作用，各企業(yè)TPT的抗炎作用與的TP含量并不完全呈正相關，因此，提示雷公藤紅素、雷公藤對醌B 等其他單體成分均與TPT 的藥效相關。因此提示，仍需進一步加強對TPT 中雷公藤對醌B、雷公藤紅素等主要單體成分的藥效學研究，明確TPT 中各成分的含量與其藥效的內在聯系，才能更加合理科學地規(guī)范該制劑的產品質量，保證臨床用藥的有效性、安全性。