賈洋洋，聶樅寧，羅興禹，楊凱輝，何春雷，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省藏茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，四川 雅安 625000)

藏茶是我國黑茶的典型代表，較好地順應(yīng)了邊疆同胞“多肉食、少果蔬”的膳食構(gòu)造，成為他們的生活必需品。近年來，黑茶因其獨特的保健功效而受到了廣大消費者的青睞[1-2]，已成為內(nèi)銷的第二大茶類。渥堆在黑茶品質(zhì)形成過程中起著主導(dǎo)性作用，在渥堆工序中，原料茶中的多酚類物質(zhì)、生物堿、氨基酸以及糖類化合物在微生物胞外酶，特別是多酚氧化酶和濕熱雙重作用下發(fā)生了氧化、還原、聚合、降解和絡(luò)合等一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，進而形成了黑茶獨有的醇和濃厚口感[3-4]。但是傳統(tǒng)黑茶在制作過程中存在著諸多問題，例如渥堆周期長、生產(chǎn)效率低、衛(wèi)生條件差、勞動強度高、成品茶質(zhì)量參差不齊，以及微生物代謝毒素等問題[5]，已成為制約黑茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，探索黑茶加工新工藝已成為茶界關(guān)注的焦點。

趙冰等[6]以普洱茶為試驗原料，添加從水果中制備的外源多酚氧化酶，結(jié)果表明，處理樣中的茶多酚、兒茶素、氨基酸、茶黃素、茶紅素總量和酶的活性存在著顯著的負(fù)相關(guān)，而茶褐素總量則顯著上升。楊富亞等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多種外源酶制成的復(fù)合酶制劑有效地促進了渥堆轉(zhuǎn)化的過程，縮短了渥堆發(fā)酵的時間，增加了茶湯的滋味成分，促進了普洱茶風(fēng)味的形成。本研究擬采用綠毛茶為原料，通過添加外源酶進行酶促氧化，結(jié)合濕熱轉(zhuǎn)化作用，探索藏茶加工新工藝，并以傳統(tǒng)加工的藏茶為對照進行感官及生化成分評價，為藏茶加工探索一條新的路徑。

1 材料與方法

1.1 供試茶樣及主要儀器設(shè)備

本試驗所用綠毛茶均為四川康潤茶業(yè)有限公司提供的一芽三四葉烘青毛茶，水分含量為5.37%。

主要儀器設(shè)備：101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱， 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA2004B型分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；UV754N 紫外可見分光光度計， 上海儀電分析儀器有限公司；恒溫恒濕箱，北京雅士林試驗設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；搗碎機，上海弗魯科技發(fā)展有限公司；循環(huán)水式真空泵，北京中興偉業(yè)儀器；SCIENTZ-18ND 冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；AXTG18G-Ⅱ臺式通用高速離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 外源酶制備及其酶活性測定

外源酶的制備：將冷凍丙酮添加到洗凈去皮的土豆中，在組織搗碎機中充分?jǐn)囁椋缓筮M行抽濾，直到用冷凍丙酮洗滌過濾至無色[8-9]，冷凍干燥，即得外源酶粉。

外源酶酶液的制備：根據(jù)試驗設(shè)計取一定量的外源酶酶粉溶于一定量0.5 mol·L-1pH 9.0的磷酸鹽緩沖液，冰浴下攪拌20 min，4 000 r·min-1離心20 min，過濾所得上清液即為外源酶酶液。

酶活力測定：取1 g外源酶酶粉溶于100 mL 1.15 mol·L-1pH 7.0的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液中，冰浴下攪拌20 min，4 000 r·min-1離心20 min，所得上清液用來測定酶活力。將2 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚(溶于1.15 mol·L-1pH 7.0的緩沖液所得)加入1 mL外源酶酶液中，在420 nm波長下測定吸光度的變化，每隔10 s記錄1次，直到3 min。用不加外源酶的反應(yīng)液做空白對照，即每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位記1 U。

1.2.2 茶坯含水量的調(diào)整和新工藝茶樣的制作

參照李艷等[10]的方法將水分調(diào)整至要求。在先前單因素試驗的基礎(chǔ)上以酶添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、茶坯含水量為試驗因素，采用Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)面分析建立數(shù)學(xué)模型，以茶葉感官審評得分為指標(biāo)優(yōu)化試驗設(shè)計，求得最優(yōu)的試驗工藝參數(shù)。選取酶量(A)、發(fā)酵溫度(B)、茶坯含水量(C)、發(fā)酵時間(D)設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗(表1)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素及水平

取適量綠毛茶，以固定壓強(3 MPa)蒸汽滅菌30 s，待冷卻至室溫，加入酶液并揉捻，使得酶液充分均勻滲入原料中；然后將茶坯置于恒溫恒濕箱中，按照正交試驗得出的最佳工藝參數(shù)設(shè)定下進行酶促發(fā)酵；酶促發(fā)酵轉(zhuǎn)化結(jié)束后，校正溫度為80 ℃，含水量30%，每5 min通風(fēng)1 min，持續(xù)60 h，取出后在80 ℃烘箱干燥得新工藝成品茶。

1.2.3 傳統(tǒng)制法茶樣制備

由雅安和龍茶廠協(xié)助制作，工藝流程：綠毛茶—蒸汽處理—渥堆、翻堆—烘干—成品茶樣。取同批原料毛茶，裝于雙層布袋中(透氣透水不漏茶)；然后混入和龍茶廠傳統(tǒng)渥堆茶堆(>2 500 kg)中，分別放置在堆心、堆面進行渥堆；每周翻堆一次，20 d后取出，在干燥箱中烘干，即傳統(tǒng)藏茶樣。

1.2.4 感官審評方法

參照GB/T 23776—2009進行感官審評。審評小組由 5 名專業(yè)評茶員組成，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官審評評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 理化指標(biāo)的測定

水分測定參照GB/T 8304—2002；水浸出物測定參照GB/T 8305—2002；茶多酚總量測定參照GB/T 8313—2002；游離氨基酸總量測定參照GB/T 8314—2002；兒茶素總量按照香莢蘭素比色法測定；可溶性糖總量按照蒽酮比色法測定[11]；茶色素按照比色系統(tǒng)分析法測定[11]；香氣組分參照文獻[12]方法測定。

1.2.6 GC-MS分析方法

GC條件：Agilent HB-5MS彈性石英毛細(xì)柱(30 m×0.32 nm×0.25 μm)；進樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣，純度≥99.999%；柱流量1.0 mL·min-1；升溫程序：初始溫度50 ℃保持5 min，以10 ℃·min-1升至250 ℃保持3 min。MS條件：離子源EI，電子能70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～600 amu；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為280 ℃。

1.2.7 定性定量方法

結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫和各香氣成分的相對保留時間進行定性，香氣組分含量用其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0和Excel 2016軟件統(tǒng)計分析，感官審評得分和理化數(shù)據(jù)方差均值的比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 新工藝參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

以酶添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)、茶坯含水量(D)為試驗自變量，以茶葉感官審評得分為響應(yīng)值(Y)，試驗方案及試驗結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 實驗設(shè)計結(jié)果

其中試驗號25～29為中心試驗，其他的為析因試驗。每項試驗均重復(fù)4次，用以估計試驗誤差。對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析(表4)，得到感官審評得分(S)的二次回歸方程：=86.64+0.053A-2.500×10-3B+3.19C-0.051D+0.030AB+0.070AC+0.020AD-0.032BC-0.020BD-0.018CD-0.97A2-0.088B2+0.50C2-0.076D2。該模型的顯著性水平P<0.000 1，說明該模型顯著程度高。失擬誤差值P=0.549 5>0.05，說明所建回歸方程與試驗擬合性較高。C(茶坯含水量)的F值最大，A(酶添加量)次之，B(發(fā)酵溫度)和D(發(fā)酵時間)的F值最小，說明茶坯含水量和酶添加量對茶葉感官得分的影響最大。從模擬項的P值顯著性分析可知，模擬一次項C與模擬二次項A2和C2均顯著(P<0.000 1)。

表4 響應(yīng)面方差分析

2.2 新工藝的最佳參數(shù)確定和驗證

圖1是感官審評得分作為響應(yīng)值的各因素交互作用曲面圖。由圖1可知，感官審評得分存在最大穩(wěn)定點。回歸模型預(yù)測的新工藝的最佳參數(shù)為酶量80 U·g-1、渥堆溫度34 ℃、含水量60%、發(fā)酵時間7 h。在此條件下得到的感官審評得分的平均值是90.41，純誤差0.057%，說明測試值與理論值基本相符，分析得到的二次方程與實際情況擬合程度較好。

圖1 各因素交互作用3D曲面圖

2.3 新工藝的效果評價

2.3.1 二種工藝成品茶感官品質(zhì)對比分析

表5表明，新工藝制作的藏茶總體品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)藏茶，其表現(xiàn)在葉色更烏潤，湯色更紅濃亮，香氣更純正，滋味更濃厚回甘。

2.3.2 二種工藝茶樣常規(guī)成分對比

由表6可知，水浸出物和氨基酸呈現(xiàn)出新工藝高于傳統(tǒng)工藝，可能是由于沒有微生物消耗的結(jié)果。茶多酚、兒茶素、可溶性糖均呈現(xiàn)出新工藝高于傳統(tǒng)工藝，可能是由于發(fā)酵時間的縮短，更有利于這些成分在茶葉中的保留。酚氨比是茶湯滋味醇和與否的重要指標(biāo)[13-14]，而水浸出物在一定程度上可以反映茶湯的滋味的濃強度和厚薄，氨基酸可以協(xié)調(diào)茶湯的滋味關(guān)系[15]。這些都表明新工藝茶樣的風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)茶樣。

2.3.3 二種工藝茶樣茶色素成分對比

兒茶素在酶促和濕熱作用下氧化聚合生成茶色素使得茶湯變得紅褐、收斂性減弱、滋味變得醇和的成分[16]。由表7可知，新工藝茶樣茶褐素含量較高，這與表5中的感官特征相符合，而傳統(tǒng)茶湯厚度不足的原因可能由于傳統(tǒng)工藝制得茶樣茶色素含量偏低造成的[17-18]。茶褐素的含量是衡量黑茶品質(zhì)好壞的一個重要的指標(biāo)[19-20]，有研究表明，多種酶都參與了茶褐素的形成過程，但是具體的形成機理比較復(fù)雜還需進一步的研究，這也是造成了新工藝茶樣品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)工藝茶樣的一個重要原因。

表5 兩種工藝成品茶感官審評

表6 兩種工藝常規(guī)滋味成分比較表

表7 二種工藝茶色素含量比較表

2.4 二種工藝香氣組分比較

由表8可知，共檢測出50種香氣組分，其中醛類占比22%，萜烯類占比20%，醇類占比18%，酮類占比18%，吡咯類、烷烴類及其他類占比14%，酯類占比10%。新工藝茶樣中，醇類占比23.36%，醛類19.64%，萜烯類17.66%，酮類17.02%，酯類8.15%。其中，具有玉蘭花香、鈴蘭香和木香的β-芳樟醇增加1.69百分點，具有木香花香的α-雪松醇增加0.49百分點，具有果香的香葉基丙酮增加2.27百分點，具有檸檬香的癸醛增加4.00百分點，具有玫瑰香的壬醛增加2.65百分點，具有木香的δ-杜松烯增加5.39百分點，具有花香的順-β-羅勒烯增加0.10百分點，具有愉快香氣的苯乙酮增加2.37百分點。這些果香型的香氣物質(zhì)改善了藏茶的風(fēng)味品質(zhì)，為輔助優(yōu)化藏茶制作工藝提供了一定的參考[21-23]。

表8 兩種工藝茶樣香氣物質(zhì)相對比例比較

3 討論

藏茶屬于黑茶類。黑茶之所以具有褐葉紅湯、陳香濃郁、醇和爽口的品質(zhì)特征，是在渥堆工序中由微生物及其分泌的胞外酶和濕熱綜合作用下產(chǎn)生的。黑茶的滋味成分是以茶多酚及其氧化產(chǎn)物為主的一個綜合體系，在這個體系中，有呈澀味的兒茶素、呈苦味的咖啡堿、呈甘甜的可溶性糖和呈鮮爽味的氨基酸。各種滋味成分相互消殺變調(diào)，相互作用，形成了黑茶特有的滋味口感。有研究表明，黑茶經(jīng)過殺青和揉捻的濕熱作用就使得其中的酯型兒茶素發(fā)生了水解，相對簡單的兒茶素的含量升高。在而后的渥堆工序中，茶多酚總量呈明顯的下降趨勢，但是各種兒茶素的變化卻是不同的。酯型兒茶素水解產(chǎn)生了簡單兒茶素和沒食子酸。而簡單兒茶素在酶促反應(yīng)和自動氧化下形成了以茶色素為主的水溶性色素，其中茶黃素、茶紅素和茶褐素都是形成黑茶品質(zhì)的關(guān)鍵成分[24-26]。黑茶的主要香氣成分來自于茶葉本身芳香物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化、異構(gòu)以及渥堆工序中酶促反應(yīng)。同時，黑茶的香氣組分與加工工藝有著密不可分的關(guān)系，梁敏敏等[27]研究表明，以碧香早品種夏茶為原料在調(diào)整渥堆和干燥的參數(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合做青工序研制出了高香型的黑毛茶。曾斌等[28]通過優(yōu)化不同的二次渥堆參數(shù)促進酶促反應(yīng)和濕熱作用，使得黑毛茶的外形和內(nèi)質(zhì)都發(fā)生了更優(yōu)異的品質(zhì)變化。而這方面在藏茶加工工藝方面卻鮮有報道。

續(xù)表8 Continued Table 8

本試驗采用了從土豆中提取的外源酶輔助發(fā)酵加工藏茶。結(jié)果表明，人為添加外源酶也能促進渥堆工序中茶多酚、兒茶素的氧化等反應(yīng)，形成藏茶的品質(zhì)。新工藝制法僅用時60 h，而茶樣發(fā)酵程度與傳統(tǒng)工藝(20 d)近乎一致，說明新工藝可有效加快綠毛茶向黑茶的轉(zhuǎn)化進程，從而避免了黑茶在傳統(tǒng)制作過程中由于帶來微生物真菌的污染[5]、品質(zhì)安全不可控、質(zhì)量參差不齊等問題。并且土豆中提取的外源酶，成本低，還不受季節(jié)限制，有可以推廣的實際價值，為后續(xù)的藏茶加工生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

氨基酸既是茶湯鮮爽味的呈味物質(zhì)，又是形成黑茶香氣物質(zhì)的前提物質(zhì)[29]，可以有效地協(xié)調(diào)茶湯各種滋味成分，與茶湯的品質(zhì)有著顯著的正相關(guān)?？扇苄蕴悄苡行У鼐徑獠铚猩飰A和多酚類地苦澀味和刺激性作用[30]。新工藝和傳統(tǒng)渥堆中的酶促反應(yīng)都可以促進氨基酸和可溶性糖的增加，但是傳統(tǒng)渥堆中由部分微生物進行生長代謝需要消耗相關(guān)的氮源和碳源，這也可能是新工藝茶樣中的糖和氨基酸高于對照樣的原因。水浸出物是溶于茶湯中的一切呈味物質(zhì)的總和，在一定程度上可以決定茶葉品質(zhì)質(zhì)量的高低。

與傳統(tǒng)茶樣對比，新工藝茶樣的氨基酸，可溶性糖和水浸出物均高于對照樣，這也表明了新工藝的茶樣的品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)茶樣。感官審評結(jié)果表明，新工藝茶樣帶有花香、甜香，湯色更橙紅明亮，滋味更醇和濃厚，這也與生化成分測定的分析是一樣的，酚氨比低于對照樣，其他成分高于對照樣。充分證明新工藝可有效地改善藏茶的外形，香氣，滋味和葉底，提高藏茶品質(zhì)。

4 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)藏茶加工工藝：鮮葉—攤放—殺青—揉捻—渥堆—干燥。而綜合整個試驗結(jié)果，外源酶輔助發(fā)酵加工藏茶的新工藝的較佳工藝參數(shù)為酶量80 U·g-1、渥堆溫度34 ℃、含水量60%、發(fā)酵時間7 h，即酶輔助新工藝流程為：綠毛茶—加入酶液—酶輔助發(fā)酵—濕熱轉(zhuǎn)化—烘干—成品茶樣。此條件下加工的藏茶茶樣具有明顯的陳香及獨特香氣，極大地改善了傳統(tǒng)黑茶的陳味及霉味。新工藝目前在生化試驗階段中取得了突破性的進展，如若想廣泛地應(yīng)用到實際的大生產(chǎn)當(dāng)中還需要進行進一步的優(yōu)化和探究。