劉興興，郭怡鯤，艾 奇*，李 彥，王立鎖，趙傳偉，潘 麗

1中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；2北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，北京 100029

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)(以下簡稱OP)是一種全身性骨骼疾病，疾病特征是低骨量和骨組織微結構的損傷和破壞[1]。隨著我國人口老齡化程度的加劇，骨質疏松和并發(fā)骨折的發(fā)生率也在增加。流行病學數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，目前全球已有超過2億的OP患者。在中國，約有1.12億人受到該疾病帶來的困擾，主要集中在40歲以上的人群中，骨質疏松癥已經成為嚴重的公共衛(wèi)生健康問題[2]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學主要治療方法是補充鈣劑與維生素D，在此基礎上從骨吸收和骨生成兩方面著手，通過抑制和促進等手段進行抗OP的治療。雖然療效顯著，但是藥物治療的毒副反應和長期依從性差的問題未得到有效解決。中醫(yī)藥在防治骨質疏松癥方面有著更大的優(yōu)勢。中藥復方和單藥均具有多靶點、多系統(tǒng)的調節(jié)作用，但具體的分子機制尚不清楚。

OP在中醫(yī)學中屬于“骨痿”“骨痹”“腰背痛”等范疇，它的發(fā)生與腎臟虧虛有著密切相關的聯(lián)系?！端貑枴ゐ粽摗酚涊d:“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”?！鹅`樞·經脈》載有：“足少陰氣絕，則骨枯”。宋代錢乙在《小兒藥證直訣》中記載了后世廣為流傳的六味地黃丸，其具有滋陰補腎、陽中求陰之功效。六味地黃丸作為治療OP的推薦用藥[3]，對于OP有較好的治療效果。Lu等[4]通過生信分析發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可以通過下調XRN1基因和ZNF家族基因的表達促進雌激素的分泌和上調MAP3K10基因的表達并下調XPO1基因和NUP54基因的表達來平衡免疫應答從而促進骨組織的形成；Wu等[5]發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能提高骨密度和外周血清骨鈣素增加OP患者的骨量；Yu等[6]研究表明六味地黃丸在常規(guī)補鈣的基礎上明顯提高OP患者的臨床顯效率和有效率。六味地黃丸治療OP的作用已經在臨床上得到了驗證，因此對其具體作用機理的研究有著非常重要的現(xiàn)實意義。網(wǎng)絡藥理學能夠揭示中藥及復方的多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的機理[7]，所以本文運用網(wǎng)絡藥理學方法對六味地黃丸化學成分、靶蛋白、靶點和所涉及的信號通路、生物學過程進行分析，探討藥物治療疾病的作用機制，為OP的進一步治療提供新的研究思路和數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 有效化合物及作用靶點的遴選

六味地黃丸由熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮6味藥組成?？诜锢枚?oral bioavailability，OB)是指經口服的藥物到達血液循環(huán)系統(tǒng)所占口服劑量的比例，它是藥物吸收、分布、代謝和排泄特性中最重要的藥動學參數(shù)之一[8]。類藥性(drug-likeness，DL)是指化合物與已知藥物的相似性。二者是評價一個化合物是否可發(fā)展為一個藥物的重要指標[9]。本研究運用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，將口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18兩個關鍵指標作為篩選藥物有效成分的標準，查詢與篩選后得到熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮的化學成分。

1.2 “中藥—化合物—靶點”網(wǎng)絡的構建

將六味地黃丸篩選后的活性成分及靶標導入至Cytoscape 3.7.0軟件中，構建“中藥—化合物—靶點”網(wǎng)絡，以探究六味地黃丸治療OP的藥理學作用機制。

1.3 OP相關疾病的靶點遴選

運用TTD數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫(通過相關性得分(relevance score)選取score≥1.5進行篩選[10])，以“osteoporosis”為關鍵詞進行檢索，記錄其靶點的名稱。

1.4 藥物靶點與骨質疏松靶點的Venn分析

將六味地黃丸化學成分的基因靶點與OP的基因靶點進行Venn分析，得到兩者的共有基因，共有基因即為六味地黃丸治療OP的作用靶點。

1.5 構建蛋白質相互作用關系網(wǎng)絡(PPI)

將上述“1.4”得到的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，蛋白種類設置為“Homo sapiens”(智人)，其余參數(shù)均保持默認，進行蛋白質相互作用PPI網(wǎng)絡圖的構建，將其結果導入至Cytoscape 3.7.0中，對蛋白相互作用網(wǎng)絡做進一步的分析及優(yōu)化。

1.6 “中藥-化合物-核心靶點”圖繪制

將上述從String中所得數(shù)據(jù)結果保存為TSV格式，并導入Cytoscape 3.7.0軟件，運用其“Network Analysis”功能進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析。根據(jù)節(jié)點度值分布(node degree distribution)、介度中心度(betweenness centrality)和接近中心度(closeness centrality)3個重要網(wǎng)絡拓撲參數(shù)進行篩選，選取三者同時在平均值之上的靶點作為六味地黃丸的關鍵核心靶點。通過Cytoscape 3.7.0軟件將中藥、化合物成分及核心靶點相連，繪制出“中藥-化合物-核心靶點”相互作用網(wǎng)絡圖。

1.7 GO富集及KEGG通路富集

將1.6所得到的核心靶點信息輸入Metascape在線分析平臺進行選擇GO富集及KEGG通路富集分析功能，得到結果并將其導出。通過OmicShare Tools對GO富集及KEGG通路富集分析中篩選出來的信號通路構建氣泡圖。

1.8 分子對接驗證

選取中藥-化合物-核心靶點網(wǎng)絡中degree值排名前3的六味地黃丸化學成分，從ZINC數(shù)據(jù)庫中取得六味地黃丸化學成分的分子結構mol2格式文件。從核心靶點PPI網(wǎng)絡中篩選degree值排名前3的靶點基因，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)獲取適合化合物的蛋白晶體結構的3D分子結構pdb格式文件，通過考慮物種選擇、配體與目標化合物之間的結構相似性以及分辨率高低得出，即選擇智人，resolution<2[11]。上述兩者的分子結構文檔均使用Auto Dock Tools 1.5.6軟件轉換為pdbqt格式，利用Auto Dock 4.2.6軟件進行分子對接。通過Pymol 2.4.0軟件將對接得分最高且構象較穩(wěn)定的化合物與靶點蛋白進行分子對接可視化分析。

2 結果

2.1 六味地黃丸化合物成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫里對六味地黃丸成分根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18的標準進行檢索和篩選，一共得到69種化合物成分，其中熟地2種、山藥16種、山茱萸20種、澤瀉6種、茯苓15種、丹皮10種。根據(jù)這69種活性化合物成分，找到其對應的靶點蛋白共198個，將蛋白輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫進行對比，刪除重復及無效靶點，最終得到171個靶點。將化合物成分及靶點導入至Cytoscape 3.7.0中，構建“中藥—化合物—靶點”網(wǎng)絡，如圖1所示，圖中圓形為六味地黃丸中藥成分，四邊形為化合物成分，菱形為靶點。

圖1 中藥—化合物—靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 Network diagram of traditional Chinese medicine-compound-target注：SD：生地；SY：山藥；ZX：澤瀉；DP：丹皮；FL：茯苓；SZY：山茱萸。Note:SD:Rehmanniae Radix;SY:Dioscorea Panthaicae Rhizoma;ZX:Alismatis Rhizoma;DP:Moutan Cortex;FL:Poria;SZY:Corni Fructus.

2.2 疾病靶點獲取結果

從TTD、Disgenet、GeneCards3個數(shù)據(jù)庫中分別檢索到42、49、4 273個骨質疏松相關靶點，經過相關性得分篩選，除去重復靶點，一共得到4 311個骨質疏松相關靶點。

2.3 藥物與疾病靶點的Venn圖建立

將上述得到的4 311個疾病相關靶點與171個有效藥物靶點進行Venn分析，共得到六味地黃丸潛在作用于OP的125個靶點，如圖2所示。

圖2 六味地黃丸治療OP潛在靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of potential targets for treatment of OP with Liuwei Dihuang Pills

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建

運用String在線數(shù)據(jù)庫的Multiple proteins工具，輸入交集靶標基因名，限定物種為Homo sapiens，獲得初步的PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡，如圖3所示。將下載的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.0，繪制高級PPI網(wǎng)絡圖，如圖4所示。該PPI網(wǎng)絡刪掉2個未參與蛋白互作的靶點，由123個節(jié)點和2 201條邊構成，節(jié)點越大，顏色越深，連線越密集，則地位越重要。初步PPI網(wǎng)絡圖靶點信息復雜，靶點之間相互作用關系和靶點重要程度模糊不清，高級PPI網(wǎng)絡在靶點相互作用的基礎上，通過Cytoscape軟件將靶點重要性和相互作用關系按照degree值大小顯示出來，更加清晰顯示出處于網(wǎng)絡圖核心地位的關鍵靶點信息。

圖3 六味地黃丸初步PPI網(wǎng)絡圖Fig.3 Preliminary PPI network diagram of Liuwei Dihuang Pills

圖4 六味地黃丸高級PPI網(wǎng)絡圖Fig.4 Advanced PPI network diagram of Liuwei Dihuang Pills

2.5 核心靶點篩選

通過將上述PPI網(wǎng)絡的TSV格式文件導入Cytoscape 3.7.0軟件，經過網(wǎng)絡拓撲屬性分析，選取滿足degree和betweenness、closeness三項數(shù)據(jù)同時在平均值之上的標靶基因作為六味地黃丸的核心靶點。如圖5～7所示，其平均度值為8，介度中心度的均值為11.7×10-3，近中心度的均值約為0.375，度越大則表示該節(jié)點在為網(wǎng)絡圖中越重要。通過篩選，以上數(shù)值在均值以上的靶點共有32個(具體見表1)，度值較高的前5位分別為AKT1(94)、IL6(90)、TP53(83)、VEGFA(83)、TNF(81)，這些靶點在PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置，可能是六味地黃丸發(fā)揮作用的關鍵所在，其相互作用關系如圖8所示。同時將核心靶點及所映射的化合物及中藥數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.0，構建“中藥—化合物—核心靶點”網(wǎng)絡，如圖9所示，每條邊表示疾病-中藥所對應靶點，中藥對應化學成分以及藥物化學成分與潛在作用靶點的相互作用關系，圖中圓形為六味地黃丸中藥成分，四邊形為化合物成分，菱形為核心靶點。其中靶點數(shù)目排名前四的是槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、薯蕷皂苷元(diosgenin)、山柰酚(kaempferol)，這4種活性成分所對應的靶點數(shù)目從高到低依次是29、12、8、5。

圖8 核心靶點PPI網(wǎng)絡圖Fig.8 PPI network diagram of core targets

圖9 藥物—化合物—核心靶點網(wǎng)絡圖Fig.9 Drugs-Compounds-Core Targets network diagram注：SD：生地；SY：山藥；DP：丹皮；FL：茯苓；SZY：山茱萸。Note:SD:Rehmanniae Radix;SY:Dioscorea Panthaicae Rhizoma;ZX:Alismatis Rhizoma;DP:Moutan Cortex;FL:Poria;SZY:Corni Fructus.

表1 核心靶點信息表Table 1 Core target information table

圖5 度值Fig.5 Degree value

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將六味地黃丸治療骨質疏松的32個核心靶點導入METASCAPE數(shù)據(jù)庫進行生物學過程分析和信號通路分析，經過校正P值，P< 0.05后，得到10個分子功能類別，其中包括RNA聚合酶II轉錄因子結合、細胞因子受體結合、磷酸酶結合等；得到10個生物學過程，其中包括對氧化應激的反應、對脂多糖的反應、積極調控細胞遷移、對活性氧的反應等；得到10個細胞成分，其中包括膜筏、RNA聚合酶II轉錄因子復合物、囊泡腔、內吞小泡等。P值越小代表富集程度越高，篩選出每個部分富集程度最高的10個結果，繪出氣泡圖如圖10A、10B、10C所示。KEGG分析得到168條信號通路，其中根據(jù)閾值P< 0.01，最小計數(shù)為3，富集因子> 1.5，取排名前20的通路建立氣泡圖，如圖11所示。

圖6 介度中心度Fig.6 Betweenness centrality

圖7 接近中心度Fig.7 Closeness centrality

圖10 核心靶點GO功能富集Fig.10 Enrichment analysis of the core target GO pathway注：A：分子功能類別；B：生物過程；C：細胞成分。圓圈大小表示所占比例，顏色深淺表示P值大小。Note:A:Molecular function categories;B:Biological process;C:Cell composition.The size of the circle represents the proportion,and the color depth represents the P value.

圖11 核心靶點KEGG通路富集分析Fig.11 Enrichment analysis of the core target KEGG pathway注：圓圈表示信號通路，圓圈大小表示所占比例，顏色深淺表示P值大小。Note:the circle indicates the signal path,the size of the circle indicates the proportion,and the color depth indicates the P value.

2.7 活性成分與核心靶點的分子對接

中藥物-化合物-核心靶點網(wǎng)絡圖中degree值前四的化合物分別為槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、薯蕷皂苷元(diosgenin)、山柰酚(kaempferol)，核心靶點PPI網(wǎng)絡中degree值前三的靶點分別是IL6、AKT1、TP53。運用Auto Dock 4.2.6軟件將所篩選的化合物以及核心靶點分別進行分子對接。一般認為，就分子對接而言，結合能(binding energy，kcal/mol)越小，表明活性物質與蛋白質之間結合的越牢固，其數(shù)值小于-4.25 kcal/mol時表示活性物質與蛋白質之間有一定結合活性，小于-5.0 kcal/mol時有較好的結合活性，小于-7.0 kcal/mol時有強烈的結合活性[12]。由分子對接結果(見表2)可知所有對接能都小于-4.25 kcal/mol，說明小分子化合物與靶蛋白之間均有結合活性。其中薯蕷皂苷元在Auto Dock系統(tǒng)進行處理時沒有可以旋轉的氫鍵，即無法發(fā)出可與受體蛋白氨基酸結合的氫鍵，所以沒有做分子對接處理。選取槲皮素與TP53(PDB ID：5mhc)、山柰酚與IL6(PDB ID：1ALU)、豆甾醇與AKT1(PDB ID：1UNQ)，借助Pymol 2.4.0軟件分別進行分子對接可視化分析(圖12)。分子對接虛擬技術發(fā)現(xiàn)，化合物均穩(wěn)定地位于口袋狀的對接口袋內。槲皮素與活性位點附近的Glu-86、Lys-87這2個氨基酸形成氫鍵結合到TP53；山柰酚與活性位點附近的Leu-64、Glu-172這2個氨基酸形成氫鍵結合到IL6；豆甾醇與活性位點附近的Glu-49這1個氨基酸形成氫鍵結合到AKT1。

表2 分子對接結果Table 2 Molecular docking results

圖12 分子對接模式圖Fig.12 Molecule docking mode diagram注：A：槲皮素-TP53(PDB ID：5mhc)；B-山柰酚-IL6(PDB ID：1ALU)；C：豆甾醇-AKT1(PDB ID：1UNQ)Note:A:Quercetin-TP53 (PDB ID:5mhc);B:Kaempferol-IL6 (PDB ID:1ALU);C:Stigmasterol-AKT1 (PDB ID:1UNQ).

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸發(fā)揮療效的主要活性成分包括槲皮素、豆甾醇、山柰酚、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇等。其中，槲皮素、豆甾醇、山柰酚對骨代謝過程起著關鍵作用。Gu等[13]證實發(fā)現(xiàn)槲皮素能有效抑制成骨細胞株MC3T3-E1的成熟前衰老，通過這一途徑能有效減少去勢骨質疏松小鼠模型的骨量丟失，發(fā)揮類雌激素樣作用。有研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠激活雌激素受體活性，提高成骨細胞株MG-63的增殖分化能力，促進成骨細胞礦化[14]。經過薯蕷皂苷元處理過的成骨細胞能顯著上調細胞內護骨素/核因子κB受體活化因子配體系統(tǒng)比值，進而減少骨吸收，達到抑制破骨細胞形成的目的[15]。Zeng等[16]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過提高成骨細胞護骨素/破骨細胞分化因子(OPG/ODF)比值和刺激卵巢顆粒細胞分化雌二醇的功能來促進和加強成骨作用。綜上所述六味地黃丸中的一些潛在分子活性成分通過抑制破骨細胞的生成、減少骨量的丟失、促進成骨作用等方面對OP具有潛在治療作用。

GO通路富集分析顯示六味地黃丸作用于疾病的過程中，主要涉及氧化應激反應、脂多糖反應、積極調控細胞遷移、活性氧反應等多種生物學過程，多個生物學進程涉及AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等核心靶點。其中，AKT1可通過激活下游效應蛋白mTORC1/S6K1調控成骨細胞(osteoblast，OB)分化及破骨細胞(osteoclast，OC)的生長。有研究證實AKT1基因敲除的小鼠骨化延遲，嚴重破壞骨的生長發(fā)育[17]。近來研究發(fā)現(xiàn)，骨質疏松的發(fā)生和發(fā)展都與免疫系統(tǒng)功能失常而產生炎癥反應直接關聯(lián)[18]。在炎癥反應中起關鍵作用的炎性細胞因子如IL6、TNF通過增加破骨細胞的骨吸收或降低成骨細胞的骨形成來打破骨轉換平衡，參與骨質疏松癥的發(fā)生和發(fā)展[19]。VEGFA能夠促進內皮細胞增殖及新血管生成，加速骨形成及重建過程，直接促進骨髓間充質干細胞及增加OB的成骨活性，降低OC溶骨活性來促進骨形成及增加骨密度，在骨質疏松的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[20]。

KEGG分析得到的通路主要涉及TNF信號通路、MAPK通路、HIF-1信號通路、PI3K/Akt通路、Toll樣受體信號通路等，說明六味地黃丸化學成分可干預某些通路來達到治療OP的目的。腫瘤壞死因子信號通路(TNF)介導的慢性炎癥相關骨重建過程是骨質疏松癥治療的重要途徑[21]，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以導致絕經后骨質疏松癥的發(fā)生，其作用機制是促進RANKL誘導的破骨細胞的形成。核心基因TNF、IL-6通過溝通TNF與RANK/RANKL/OPG信號通路的信號轉導，調控骨吸收-骨重建平衡[22]。MAPK通路可以通過調控OC的分化影響OP的進展。有研究證實MAPK在激活后直接參與OC前體細胞分化成為成熟OC，并通過自噬參與OC的分化[23]。OP發(fā)生的主要原因是重要的治療靶點破骨細胞的過度激活。PI3K/Akt通路與成骨和破骨通路緊密聯(lián)系，調控著成骨細胞和破骨細胞存活、分化過程從而維持骨量和骨轉換平衡。激活PI3K/Akt信號通路可以促進堿性磷酸酶(ALP)、BMP-2等成骨分化標志物的表達，促進成骨細胞增殖和分化。同時PI3K/Akt信號通路的存在對于破骨細胞的存活起到至關重要的作用。Toll樣受體是一類非特異性免疫受體，Toll-like信號通路在骨代謝中扮演著重要角色。其中Toll樣受體4(TLR4)信號途徑可通過激活ERK、p38、JNK和NF-κB通路與其他成骨相關通路相互聯(lián)系，并影響成骨細胞分化、增殖、礦化及凋亡[24]。骨吸收-骨重建動態(tài)平衡是在成骨細胞-破骨細胞耦聯(lián)的基礎上形成的，對于OP的發(fā)生和治療非常關鍵。缺氧誘導因子-1信號通路(HIF-1)對于成骨細胞、破骨細胞的增殖分化凋亡有著密切相關的關系。HIF-1具有活化破骨細胞的作用，骨質疏松癥患者雌激素的缺乏可使機體降低抑制HIF-1活化破骨細胞的作用，加重骨質疏松癥發(fā)展。因此，推測六味地黃丸通過TNF信號通路、MAPK通路、HIF-1信號通路、PI3K/Akt通路、Toll樣受體信號通路等信號通路調控AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等關鍵靶點治療OP。將六味地黃丸的潛在活性成分與關鍵靶點進行分子對接，結果發(fā)現(xiàn)槲皮素、豆甾醇、山柰酚等化合物與TP53、AKT1、IL6等對應靶點結合能均小于-5.0 kcal/mol，提示六味地黃丸中的潛在活性成分與關鍵靶點有著較好的結合活性，說明它們可能是治療OP的潛在活性成分。說明通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接手段預測出六味地黃丸治療OP的潛在活性成分和關鍵靶點是具有一定的科學依據(jù)和理論支撐的。

本文通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接驗證提示，六味地黃丸通過調節(jié)骨代謝、調控炎癥反應、細胞增殖分化等來預防和治療OP，具有多成分、多靶點、多通路的作用特征。同時為中醫(yī)藥防治OP的具體作用機制提供多維化視角，更有利于中醫(yī)藥的傳承、創(chuàng)新與發(fā)展，有利于后續(xù)實驗研究的深入化和臨床思路的拓展，也為今后藥物研發(fā)等方面提供基礎理論支撐。但是由于該研究主要依托于數(shù)據(jù)庫信息，考慮中藥煎煮及在體內活性成分可能發(fā)生變化的復雜性，藥物具體作用機制的確認仍需通過進一步的實驗來驗證。