陳重旭，游方芳，金桂蘭，程 凡，鄒 坤，邢翔飛，奚 煒，陳劍鋒*

1三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室；2宜昌市第一人民醫(yī)院，宜昌443002

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，目前臨床上對其治療仍以手術(shù)和放化療為主，但由于宮頸癌多為浸潤性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、易擴散的特點，往往導(dǎo)致治療預(yù)期不佳[1]。因此，尋找能抑制其侵襲和遷移的新型抗宮頸癌化療藥物備受關(guān)注。天然來源的藥物因其多靶點、有效低毒的優(yōu)勢一直受到學(xué)者的重視。RCE-4是本實驗室從百合科鈴蘭族吉祥草(Reineckiacarnea(Andr.) Kunth)植物中分離得到的一個螺甾烷型皂苷，化學(xué)名稱為(1β,3β,5β,25S)-螺甾烷-1,3-diol1-[α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-木吡喃糖苷]，結(jié)構(gòu)見圖1，其在吉祥草總皂苷中的含量最高(達13%)，同時其藥理活性也最好，RCE-4現(xiàn)已作為吉祥草的標(biāo)志性成分被湖北省地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)收錄[2]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，RCE-4對宮頸癌Ca Ski細(xì)胞具有較好的選擇性細(xì)胞毒性[3,4],能顯著抑制裸小鼠Ca Ski細(xì)胞移植瘤生長，最高抑瘤率可達到69.1%，給藥組小鼠的子宮、卵巢等重要組織均未見瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤和病理改變[5]。在前期結(jié)果的啟發(fā)下，我們推測RCE-4可能具有抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用，目前相關(guān)活性及其分子作用機制尚未見任何報道。

Wnt/β-catenin和Hippo/YAP是與腫瘤侵襲和遷移關(guān)聯(lián)較為密切的兩條細(xì)胞內(nèi)信號通路，二者均通過其核心信號分子(β-catenin和YAP/TAZ)由胞漿進入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合轉(zhuǎn)錄下游靶基因從而調(diào)控腫瘤的侵襲和遷移[6-8]。阻斷Wnt/β-catenin通路對腫瘤的增殖具有顯著的抑制作用[9]。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活可引起生長發(fā)育缺陷和腫瘤的發(fā)生以及遷移、侵襲[10,11]。下調(diào)Wnt/β-catenin 通路下游蛋白如MMP2、MMP9等可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12]。與 Wnt/β-catenin 通路的生物學(xué)功能相反，Hippo/YAP 通路活化后抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡[13]。在沒有 Hippo 相關(guān)激活因子刺激的情況下，非磷酸化狀態(tài)的 YAP 轉(zhuǎn)移入核，與轉(zhuǎn)錄激活因子 TEAD/TEF 家族相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達[14]。胞外刺激信號可通過尚不明確的機制活化 Mst1/2，再通過一系列的級聯(lián)磷酸化反應(yīng)磷酸化其他核心成員。

因此，本研究將以宮頸癌Ca Ski細(xì)胞為對象，通過Wnt/β-catenin和Hippo/YAP兩條信號通路系統(tǒng)研究RCE-4對宮頸癌增殖、侵襲和遷移的影響及其分子作用機制，為RCE-4將來的臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞株

人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供，本實驗室培養(yǎng)保存。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 °C、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RCE-4由本實驗室從吉祥草中分離并進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)構(gòu)見圖1；一抗p-GSK3β、GSK3β、p-β-catenin、β-catenin、c-Myc、MMP2、MMP7、MMP9、MMP14、VCAM-1、ICAM-1、MST1、p-MST1、NUAK2、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP、CYR61、SOX2、PAK4、YAP/TAZ和β-actin(美國Cell Signaling Technology公司)；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG(愛必信生物科技有限公司)；1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；MTT(美國Amersco公司)；ECL超敏發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；DAPI染色試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

圖1 RCE-4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of RCE-4

1.3 實驗儀器

酶標(biāo)儀(瑞士TECAN infinite F200 PRO)；熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司XD30A-RFL)；CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；超低溫保存箱(安徽中科都菱商用電器股份有限公司)；低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；高速冷凍離心機(德國，eppendorf公司)；超純水儀(上海和泰儀器有限公司Smart-S15UVF)；電泳儀(北京基昂生物科技有限公司)。

1.4 MTT實驗

將對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化計數(shù)后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配置成適合濃度的細(xì)胞懸液。以2×104個/孔的密度接種到96孔板中，設(shè)置6個平行孔，在37 °C，5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入含有不同濃度RCE-4處理48 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，震動5 min，490 nm處測量OD值。

1.5 平板克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞，常規(guī)消化，制備單細(xì)胞懸液并計數(shù)。以3 000個/孔的密度接種到6孔板中，以十字方向輕晃動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。在37 °C，5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞用不同濃度的RCE-4分別處理24、48、72 h。處理后用無藥物培養(yǎng)基代替并培養(yǎng)14天。在此期間，每兩天更換一次培養(yǎng)基。孵育完成后，PBS小心洗滌6孔板兩次，在室溫下用甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min。拍照并使用ImageJ軟件(1.44I版)計數(shù)菌落數(shù)。

1.6 劃痕實驗

取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞，以5×105/孔的密度接種在6孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達到90%時，以200 μL移液槍吸管頭部刮出三個平行傷口，并用PBS清洗孔板兩次以去除掉落的細(xì)胞。使用含有2%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)以消除細(xì)胞增殖的影響。每組給予不同濃度的藥物，處理24 h后置細(xì)胞培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 Transwell侵襲實驗

將基質(zhì)膠(50 μL，用無血清培養(yǎng)基以1∶4稀釋)垂直添加到Transwell小室(BD Biosciences，San Jose，CA)的底部，并將小室在培養(yǎng)箱中干燥以備使用。取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞，消化重懸，調(diào)整濃度至1×106個/mL。將200 μL細(xì)胞懸液添加到上腔室中，并同時給藥。在下腔室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在37 °C下孵育24 h后，使用棉簽去除殘留在膜上表面的非侵入性細(xì)胞，用甲醇固定穿過膜的細(xì)胞10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，然后在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野進行計數(shù)。

1.8 Transwell遷移實驗

Transwell遷移實驗的步驟與侵襲實驗步驟相同，只是Transwell上腔室的表面沒有被基質(zhì)膠覆蓋。

1.9 間接免疫熒光實驗

取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞，常規(guī)消化，制備單細(xì)胞懸液并接種于孔板中。將玻璃蓋玻片上的細(xì)胞孵育至60%～80%匯合度，在不同濃度藥物的作用后，取出細(xì)胞爬片，PBS洗3次，100%甲醇冷卻并固定15 min，并用PBS-0.1%Triton X-100滲透15 min，3%BSA封閉后，將細(xì)胞與抗β-catenin和抗YAP/TAZ抗體在4 °C孵育過夜。PBS洗三次后，將細(xì)胞與抗兔熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)的二抗(Bioworld，1∶200稀釋)避光孵育2 h，并用DAPI染色細(xì)胞核，然后通過熒光顯微鏡進行觀察、拍照。

1.10Western blot實驗

取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞用不同濃度的RCE-4處理6、12、24 h后，用含有蛋白酶抑制劑(1%PMSF，1%磷酸化蛋白酶抑制劑)的RIPA裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)，在冰上孵育30 min，并在4 °C下以12 000 rpm離心10 min，以獲得蛋白質(zhì)。核蛋白通過核蛋白提取試劑盒(GBCBIOT Technologies，中國廣州)提取。上清液中的蛋白質(zhì)含量使用BCA分析試劑盒(中國北京碧云天)進行測量。用5×上樣緩沖液和水將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同濃度。在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京Labgic Technology Co.，Ltd.)上。用5%脫脂奶將膜封閉2 h后，將蛋白質(zhì)樣品與相應(yīng)的一抗在4 °C下孵育16 h。用Tris緩沖鹽水Tween-20(TBST)洗滌3次×10 min，然后使用適當(dāng)?shù)亩惯M行孵育。隨后使用ECL試劑(北京碧云天)可視化凝膠條帶，并使用發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200)記錄結(jié)果。

1.11統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism軟件(5.0版，LaJolla，CA，美國)進行，以mean±SD表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCE-4對Ca Ski細(xì)胞增殖的抑制作用

為了研究RCE-4對Ca Ski細(xì)胞增殖的影響，使用MTT法檢測了細(xì)胞系的增殖能力。MTT實驗結(jié)果(見圖2A)表明，RCE-4對Ca Ski細(xì)胞具有顯著的抑制作用，IC50為4.71 μM。采用平板克隆形成實驗反映單個細(xì)胞的增殖能力，在孔板中接種密度較小的細(xì)胞使之成為單個細(xì)胞，能形成可見克隆的細(xì)胞必為貼壁且有增殖能力的細(xì)胞?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果(見圖2B、2C)顯示，與對照組相比，RCE-4能以劑量和時間依賴方式明顯減少Ca Ski細(xì)胞的集落。

圖2 RCE-4對Ca Ski細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 RCE-4 can inhibit the proliferation of Ca Ski cells注：(A)RCE-4處理Ca Ski細(xì)胞48 h后通過MTT法測定評估增殖抑制效應(yīng)；(B)Ca Ski細(xì)胞分別用各種濃度(0、4、8和12 μM)的RCE-4處理24 h、48 h和72 h。細(xì)胞活力通過集落形成試驗確定；(C)直方圖表示Ca Ski細(xì)胞集落數(shù)的數(shù)目。數(shù)據(jù)表示為三個實驗的平均值±SD。與對照組相比，***P <0.001。Note: (A) Ca Ski cells were treated with RCE-4 for 48 h,and proliferation inhibition was assessed by MTT assay;(B) The Ca Ski cells were treated with various concentrations (0,4,8 and 12 μM) of RCE-4,respectively for 24 h,48 h,and 72 h.The cell viability was determined by colony formation assay;(C) The histogram indicates the number of Ca Ski cell colony numbers.Data are expressed as the mean ± SD of three experiments.Compared with control group,***P < 0.001.

2.2 RCE-4對Ca Ski細(xì)胞遷移的影響

我們采用了劃痕實驗和Transwell遷移來探討RCE-4對Ca Ski細(xì)胞體外遷移的影響。劃痕試驗(見圖3A、3B)和Transwell小室實驗(見圖3C、3D)的結(jié)果均表明，RCE-4能極顯著(P<0.001)的抑制Ca Ski細(xì)胞的體外遷移。

圖3 RCE-4抑制了Ca Ski細(xì)胞的遷移Fig.3 RCE-4 can inhibit the migration of Ca Ski cells注：(A)用不同濃度的RCE-4處理接種在六孔板上的Ca Ski細(xì)胞。給藥24 h后，細(xì)胞遷移的變化。比例尺：400 μm；(B)直方圖表示24 h后Ca Ski細(xì)胞中傷口愈合的百分比；(C)在具有不同濃度的RCE-4的Ca Ski細(xì)胞上進行Transwell遷移測定24 h。將穿過膜的細(xì)胞染色并在顯微鏡下觀察；(D)直方圖表示穿過膜的Ca Ski細(xì)胞的數(shù)量。比例尺：100 μm。數(shù)據(jù)表示為三個實驗的平均值±SD。與對照組相比，**P <0.01，***P<0.001。Note: (A) Ca Ski cells inoculated on six-well plates were treated with various concentrations of RCE-4.After administration for 24 hours,the cells migration was recorded.Scale bars: 400 μm;(B) The histogram indicates the percentage of wound healing in Ca Ski cells after 24 h;(C) Transwell migration assays were performed on Ca Ski cells for 24 h with different concentrations of RCE-4.The cells that passed through the membrane were stained and observed under a microscope;(D) The histogram indicates the number of Ca Ski cells passing through the membrane.Scale bars: 100 μm.Data are expressed as the mean ± SD of three experiments.Compared with control group,**P < 0.01,***P < 0.001.

2.3 RCE-4對Ca Ski細(xì)胞侵襲的影響

為了闡明RCE-4在抑制Ca Ski細(xì)胞侵襲中的影響，我們采用了Transwell侵襲實驗。在Transwell小室的底部添加基質(zhì)膠，以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)果如圖4A、4B所示，RCE-4以劑量依賴性方式顯著抑制Ca Ski細(xì)胞的侵襲(P<0.001)。

圖4 RCE-4抑制了Ca Ski細(xì)胞的侵襲Fig.4 RCE-4 can inhibit the invasion of Ca Ski cells注：(A)在不同濃度的RCE-4上對Ca Ski細(xì)胞進行24 h Transwell侵襲測定。將基質(zhì)膠添加到Transwell腔室的底部，以模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)。將通過基質(zhì)膠的細(xì)胞染色并在顯微鏡下觀察。比例尺：100 μm；(B)直方圖表示穿過基質(zhì)膠的Ca Ski細(xì)胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為三個實驗的平均值±SD。與對照組相比，***P <0.001。Note: (A) Transwell invasion assays were performed on Ca Ski cells for 24 h in different concentrations of RCE-4.Matrigel was added to the bottom of the Transwell chambers to mimic the extracellular matrix in the body.The cells that passed through the matrigel were stained and observed under a microscope.Scale bars: 100 μm;(B) The histogram indicates the number of Ca Ski cells passing through the matrigel.Data are expressed as the mean ± SD of three experiments.Compared with control group,***P < 0.001.

2.4 RCE-4對β-catenin由胞漿入核的影響

β-catenin由胞漿入核是整個Wnt/β-catenin信號通路激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。β-catenin入核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄出諸多下游蛋白，從而促進腫瘤細(xì)胞遷移。我們分別采用間接免疫熒光實驗及Western blot方法來評估RCE-4對β-catenin入核的影響。間接免疫熒光實驗(見圖5A、5B)和Western blot實驗(見圖5C、5D)結(jié)果均表明，RCE-4以時間和劑量依賴的方式顯著的抑制了β-catenin由胞漿進入細(xì)胞核。

圖5 RCE-4對β-catenin核轉(zhuǎn)錄的抑制作用Fig.5 RCE-4 inhibits the nuclear translocation of β-catenin注：(A)通過免疫熒光評估β-catenin在Ca Ski細(xì)胞中的位置。使用抗β-catenin抗體對培養(yǎng)的Ca Ski細(xì)胞進行免疫熒光染色。比例尺：100 μm；(B)直方圖表示(A)中的細(xì)胞熒光強度比；(C)在用各種濃度的RCE-4處理6、12、24 h后，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測到β-catenin的表達；(D)直方圖顯示(C)中的相對蛋白質(zhì)。綠色表示β-catenin的表達，藍色表示核染色的DAPI。條形圖表示上述蛋白質(zhì)的平均值±SD。與對照組相比，***P <0.001。Note: (A) The location of β-catenin in Ca Ski cells was assessed by immunofluorescence.Cultured Ca Ski cells were suffered immunofluorescence staining with anti-β-catenin antibody.Scale bars: 100 μm;(B) The histogram indicates the cell fluorescence intensity ratio in (A);(C) The expression of β-catenin was detected by western blotting after treatment with various concentrations of RCE-4 for 6 h,12 h and 24 h;(D) The histogram shows the relative protein in (C).The green indicated the expression of β-catenin,and the blue denoted nuclear stained DAPI.The bar graphs represent the mean ± SD of the above proteins.Compared with control group,***P<0.001.

2.5 RCE-4對YAP/TAZ由胞漿入核的影響

同β-catenin相似，YAP/TAZ蛋白分子由胞漿入核是整個Hippo/YAP信號通路激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。YAP/TAZ入核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄出諸多下游蛋白，從而促進腫瘤細(xì)胞侵襲。我們同樣分別采用間接免疫熒光實驗及Western blot方法來評估RCE-4對YAP/TAZ入核的影響。間接免疫熒光實驗(見圖6A、6B)和Western blot實驗(見圖6C、6D)結(jié)果均表明，RCE-4以時間和劑量依賴的方式顯著的抑制了YAP/TAZ由胞漿進入細(xì)胞核。

圖6 RCE-4對YAP/TAZ核轉(zhuǎn)錄的抑制作用Fig.6 RCE-4 inhibits the nuclear translocation of YAP/TAZ注：(A)通過免疫熒光測定法評估YAP/TAZ在Ca Ski細(xì)胞中的位置。用抗YAP/TAZ抗體對培養(yǎng)的Ca Ski細(xì)胞進行免疫熒光染色。比例尺：100 μm；(B)直方圖表示(A)中的細(xì)胞熒光強度比；(C)在用各種濃度的RCE-4處理6 h、12 h和24 h后，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測到Y(jié)AP/TAZ的表達；(D)直方圖表示(C)中的相對蛋白質(zhì)表達。綠色表示YAP/TAZ的表達，藍色表示核染色的DAPI。條形圖表示上述蛋白質(zhì)的平均值±SD。與對照組相比，***P <0.001。Note: (A) The location of YAP/TAZ in Ca Ski cells was assessed by immunofluorescence assays.Cultured Ca Ski cells were subjected to immunofluorescence staining with anti-YAP/TAZ antibody.Scale bars: 100 μm;(B) The histogram indicates the cell fluorescence intensity ratio in (A);(C) The expression of YAP/TAZ was detected by western blotting after treatment with various concentrations of RCE-4 for 6 h,12 h and 24 h;(D) The histogram indicates the relative protein expression in (C).The green indicated the expression of YAP/TAZ,and the blue denoted nuclear stained DAPI.The bar graphs represent the mean ± SD of the above proteins.Compared with control group,***P<0.001.

2.6 RCE-4對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控

在Wnt/β-catenin信號通路中，PAK4、GSK3β和磷酸化的β-catenin等共同調(diào)控著β-catenin的入核，其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員，與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)。Western blot實驗結(jié)果(見圖7A～7D、8A～8D)顯示，不同濃度的RCE-4作用Ca ski細(xì)胞6 h和12 h之后可以顯著增強p-β-catenin的表達，作用24 h之后可以顯著增強GSK3β的表達。同時，Wnt/β-catenin信號通路中的其它關(guān)鍵蛋白如PAK4、p-GSK3β、β-catenin以及下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物MMP2、MMP7、MMP9、MMP14、c-Myc均以時間和劑量依賴的方式被顯著抑制，表明RCE-4抑制了Ca Ski細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活。

圖7 RCE-4對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控Fig.7 RCE-4 inhibits Wnt/β-catenin signaling pathway注：(A)在用不同濃度的RCE-4處理6 h、12 h和24 h后通過免疫印跡檢測PAK4、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin和p-β-catenin的表達。β-actin作為內(nèi)參；(B)直方圖表示(A)中6 h的相對蛋白表達；(C)直方圖表示(A)中12 h的相對蛋白質(zhì)表達；(D)直方圖顯示(A)中24 h的相對蛋白質(zhì)表達。條形圖表示上述蛋白質(zhì)的平均值±SD。與對照組相比，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note: (A) The expressions of PAK4,GSK3β,p-GSK3β,β-catenin and p-β-catenin and were detected after treatment with various concentrations of RCE-4 for 6 h,12 h and 24 h by immunoblotting.β-actin was included as loading control;(B) The histogram indicates the relative protein expression of 6 h in (A);(C) The histogram indicates the relative protein expression of 12 h in (A);(D) The histogram shows the relative protein expression of 24 h in (A).The bar graphs represent the mean ± SD of the above proteins.Compared with control group,*P< 0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.7 RCE-4對Hippo/YAP信號通路的調(diào)控

在Hippo/YAP信號通路中，MST1、p-MST1、NUAK2、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP等共同調(diào)控著YAP/TAZ的入核，其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要為包括VCAM-1、ICAM-1、CYR61、SOX2等成員，與腫瘤細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。Western blot實驗結(jié)果(見圖8A～8D、9A～9D)顯示，RCE-4可以以時間和劑量依賴的方式顯著抑制MST1、LATS1、NUAK2、YAP/TAZ、YAP、VCAM-1、ICAM-1、CYR61、SOX2的表達，在作用6 h和12 h的時候顯著增強p-YAP、p-LATS1的表達，表明RCE-4顯著激活了Ca Ski細(xì)胞中Hippo/YAP信號通路。 詳細(xì)機制圖如圖10所示。

圖8 RCE-4對下游靶蛋白表達的影響Fig.8 RCE-4 inhibits the downstream target proteins expression注：(A)經(jīng)不同濃度的RCE-4處理6、12 和24 h后，免疫印跡法檢測MMP2、MMP7、MMP9、MMP14、c-Myc、VCAM-1、ICAM-1、CYR61和SOX2的表達。β-actin作為內(nèi)參。(B)直方圖顯示(A)中6 h的相對蛋白表達。(C)直方圖顯示(A)中12 h的相對蛋白質(zhì)表達。(D)直方圖顯示(A)中24 h的相對蛋白質(zhì)表達。條形圖表示上述蛋白質(zhì)的平均值±SD。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note: (A) The expressions of MMP2, MMP7, MMP9, MMP14, c-Myc, VCAM-1, ICAM-1, CYR61 and SOX2 were detected after treatment with various concentrations of RCE-4 for 6, 12 and 24 h by immunoblotting, β-actin was included as loading control; (B) The histogram shows the relative protein expression of 6 h in (A) ; (C) The histogram shows the relative protein expression of 12 h in (A) ; (D) The histogram shows the relative protein expression of 24 h in (A). The bar graphs represent the mean ± SD of the above proteins. Compared with control group, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

圖9 RCE-4對Hippo/YAP信號通路的調(diào)控Fig.9 RCE-4 activates Hippo/YAP signaling pathway注：(A)用不同濃度的RCE-4處理6、12和24 h后，檢測MST1、p-MST1、NUAK2、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP和YAP/TAZ的表達。β-actin作為內(nèi)參；(B)直方圖表示(A)中6 h的相對蛋白表達；(C)直方圖表示(A)中12 h的相對蛋白質(zhì)表達；(D)直方圖顯示(A)中24 h的相對蛋白質(zhì)表達。條形圖表示上述蛋白質(zhì)的平均值±SD。與對照組相比，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note: (A) The expressions of MST1,p-MST1,NUAK2,LATS1,p-LATS1,YAP,p-YAP and YAP/TAZ were detected after treatment with various concentrations of RCE-4 for 6,12 and 24 h by immunoblotting. β-actin was included as loading control; (B) The histogram indicates the relative protein expression of 6 h in (A); (C) The histogram indicates the relative protein expression of 12 h in (A); (D) The histogram shows the relative protein expression of 24 h in (A). The bar graphs represent the mean ± SD of the above proteins. Compared with control group,*P< 0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 討論

本實驗室前期通過MTT實驗已顯示RCE-4可呈時間和劑量依賴的方式抑制Ca Ski細(xì)胞的增殖，本研究克隆形成實驗的結(jié)果進一步的驗證了RCE-4的有效性。另外，通過劃痕實驗以及Transwell小室體外侵襲實驗檢測了RCE-4對Ca Ski細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示，RCE-4能顯著抑制Ca Ski細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且具有濃度依賴性。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的遷移中發(fā)揮著重要作用，β-catenin的入核是該通路激活的關(guān)鍵[15]。結(jié)果顯示，RCE-4可通過抑制p-GSK3β的表達、促進β-catenin的磷酸化以及抑制PAK4的表達三種途徑共同抑制β-catenin的入核，進而抑制下游基因基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/7/9/14等的轉(zhuǎn)錄。有意思的是，最新的研究發(fā)現(xiàn)，抑制PAK4的活性可以協(xié)同增強PD-1免疫阻斷療法的治療效果[16]。PD-1療法在腫瘤組織缺乏免疫細(xì)胞預(yù)先浸潤的情況下，療效甚微，這也是PD-1療法產(chǎn)生抗藥性的主要原因[17]。使用PAK4抑制劑后可顯著增強體內(nèi)瘤組織對PD-1阻斷療法的響應(yīng)，考慮到RCE-4對PAK4顯著的抑制作用，這為我們提供了新的研究方向。

Hippo/YAP信號通路與腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)系也已得到證實[18]，但到目前為止，針對Hippo/YAP信號通路的藥物還相對較少。2018年，Gill等[19]發(fā)現(xiàn)，該通路圍繞YAP/TAZ分子入核過程存在著一個特殊的正反饋循環(huán)，該循環(huán)由NUAK2、LATS1、p-LATS1、胞漿內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)YAP/TAZ五個蛋白分子組成，NUAK2可以通過抑制LATS1的表達以阻止LATS1的磷酸化，從而促進YAP/TAZ復(fù)合物分子由胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，進入核內(nèi)的YAP/TAZ分子與NUAK2轉(zhuǎn)錄子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄出的NUAK2進入胞漿，以此形成正反饋循環(huán)。該循環(huán)的發(fā)現(xiàn)使Hippo/YAP信號通路更顯復(fù)雜，也解釋了調(diào)控Hippo/YAP信號通路以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的困難性。本實驗結(jié)果顯示，RCE-4可以通過多條途徑，包括抑制MST1的磷酸化、增強YAP的磷酸化以及減少YAP的表達等共同抑制YAP/TAZ的入核，核內(nèi)YAP/TAZ的減少又導(dǎo)致NUAK2的表達降低，從而打破了此正反饋循環(huán)。循環(huán)的打破導(dǎo)致其下游細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、CYR61以及SOX2等蛋白表達的減少，Ca Ski細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制。

值得注意的是，細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin和Hippo/YAP兩條信號通路并非毫無聯(lián)系，二者在很多方面存在交互作用[20,21]，比如磷酸化的YAP/TAZ能與β-catenin結(jié)合導(dǎo)致β-catenin滯留在胞質(zhì)中，從而抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性[22]。YAP可以誘導(dǎo)GSK3β的失活，失活的GSK3β進而穩(wěn)定胞質(zhì)的β-catenin，促進β-catenin的核轉(zhuǎn)移[23]。本研究尚未對兩條信號通路的互反饋調(diào)控進行深入研究，同時，本階段的研究也具有一定的局限性，對于如Hela、SiHa等其它宮頸癌細(xì)胞株還未進行驗證，以及缺少動物實驗結(jié)果，這也是我們下一步的研究方向。

綜上所述，RCE-4具有較好的抑制Ca Ski細(xì)胞侵襲和遷移的能力，其分子作用機制主要是通過阻止β-catenin和YAP/TAZ的入核這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化以及激活Hippo/YAP信號通路來實現(xiàn)。