肖 瑩，華永麗，賈婭倩，董嘉琪，李 芳，魏彥明，袁子文，紀(jì) 鵬

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)是豆科槐屬多年生草本植物，主要分布在我國(guó)西北干旱半干旱荒漠草地、鹽堿地、沙丘，屬耐鹽堿沙生植物[1]。具有清熱解毒、除濕作用，對(duì)胃腸道等疾病具有很好的治療作用。生物堿是苦豆子的主要活性成分之一，研究顯示苦豆子生物堿對(duì)心肌炎、肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)都具有良好的治療效果[2]。本課題組前期研究也證明苦豆子總堿對(duì)UC具有良好療效。

UC是一種病因尚未明確的非特異性結(jié)腸炎癥，病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層[3]，與遺傳、環(huán)境、腸道微生態(tài)和免疫失衡等等多種因素有關(guān)[4]，這些因素導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂、腸黏膜上皮功能障礙、黏膜免疫反應(yīng)異常，最后導(dǎo)致腸道反復(fù)炎癥，引起UC的發(fā)生發(fā)展[5,6]。近年研究已證實(shí)膽汁酸與腸道疾病有密切關(guān)系[7]，其UC的產(chǎn)生原因?yàn)槟c道菌群失衡、上皮功能障礙和異常的免疫應(yīng)答，而膽汁酸通過多種途徑都參與這些過程[8]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿可以降低UC小鼠血清中的總膽汁酸(TBA)和總膽固醇(T-CHO)水平，膽汁酸靶向代謝組學(xué)結(jié)果顯示血清中α-鼠膽酸(α-muricholic acid，α-MCA)、β-鼠膽酸(β-muricholic acid，β-MCA)、ω-鼠膽酸(ω-muricholic acid，ω-MCA)和膽酸(cholic acid，CA)在模型組顯著升高，而苦豆子總堿治療后顯著下降[9]。膽汁酸在胃腸道中主要通過兩個(gè)受體影響其功能，分別為法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5，TGR5)，F(xiàn)XR和TGR5因發(fā)現(xiàn)其在肝臟和結(jié)腸大量表達(dá)，并在炎癥調(diào)節(jié)中有非常重要的作用，可能成為治療UC非常有價(jià)值的標(biāo)靶[10,11]。UC的主要標(biāo)志就是黏膜炎癥，F(xiàn)XR可以調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]，其水平可有效反映潰瘍性結(jié)腸炎的病情嚴(yán)重程度[13]。肝臟和腸道有著密切的聯(lián)系[14]，膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)通過滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膽固醇7α-羥化酶CYP7A1(cholesterol 7α-hydroxylase)啟動(dòng)的中性(或經(jīng)典)途徑，合成膽汁酸[15,16]，膽汁酸在體內(nèi)作為一種信號(hào)分子，通過激活FXR、TGR5受體調(diào)控機(jī)體代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿雖然可以影響血清膽汁酸的變化，但是膽汁酸合成通路受FXR/TGR5的調(diào)控，具體苦豆子總堿如何通過FXR/TGR5通路影響血清膽汁酸的變化還不明確。因此，本研究以苦豆子總堿為研究對(duì)象，采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，分析苦豆子總堿對(duì)小鼠結(jié)腸和肝臟組織FXR、TGR5、CYP7A1蛋白的表達(dá)影響，以探討苦豆子總堿對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠FXR/TGR5通路的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只雄性BALB/c小鼠(8周齡，18～20 g)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)20200006。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天開始實(shí)驗(yàn)，小鼠飼養(yǎng)條件：溫度24±2 ℃、濕度50%±5%、12 h明暗循環(huán)。全價(jià)配合飼料以及純凈水供小鼠自由攝取。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序與福利均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理批準(zhǔn)編號(hào)：GSAU-AEW-2020-0911)。

1.2 藥物與試劑

苦豆子采自寧夏沙漠邊緣，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)魏彥明教授鑒定。柳氮磺胺嘧啶(salazosulfapyridine，SASP)腸溶片，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020557，購(gòu)自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)(M.W.=36 000～50 000)購(gòu)自MP公司；白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、IL-23、IL-17、IL-1β小鼠ELISA試劑盒均購(gòu)于欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒500微孔購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)PC0020；總膽固醇TCH試劑盒(貨號(hào)A111-1-1)、總膽汁酸TBA試劑盒(貨號(hào)E003-2-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Rabbit Polyclonal Antibody：FXR/NR1H4、CYP7A1 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TGR5/GPBAR1購(gòu)自CUSABIO生物科技有限公司；beta Actin、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購(gòu)自Proteintech生物科技有限公司。RIPA裂解液、上樣Loading Buffer、SDS、TEMED、BIS-ACR、SDS-PAGE分離膠/濃縮膠緩沖液、Tris、甘氨酸、吐溫80、PVDF膜、脫脂奶粉均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。ECL發(fā)光液購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.3 儀器

美國(guó)MD光吸收酶標(biāo)儀，SpectraMaxPlus84/190/Versamax/340PC；Olympus DP-71顯微照相系統(tǒng)，日本Olympus公司；冷凍型高通量組織研磨機(jī)；Bio-Rad小型垂直板電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽、電泳儀均購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；紫外分光光度計(jì)。

1.4 藥物制備

稱取20 g苦豆子，研磨并用20目篩子篩選后以50%乙醇提取溶劑，提取3次，提取時(shí)間分別為12、8、4 h，加入提取劑的量分別為12、10及8倍?；旌先螢V液，濃縮，并制成干膏，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總生物堿含量測(cè)定：稱取0.025 g苦豆子溶于5 mL乙醇，吸出30 μL揮發(fā)溶劑后分別加6 mL溴麝香草酚藍(lán)和氯仿振蕩混勻，靜置2 h，紫外分光光度計(jì)420 nm處測(cè)得總生物堿含量為246 mg/g。

1.5 動(dòng)物造模與藥物治療

將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(control group，Con)、葡聚糖硫酸鈉模型組(dextran sulfate sodium model group，DSS)、陽(yáng)性對(duì)照組(salazosulfapyridine group，SASP)、苦豆子總堿組(total alkaloids fromSophoraalopecuroidesgroup，TASA)，每組15只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。除空白對(duì)照組給予蒸餾水外，其余組給予 BALB/c小鼠3.5%DSS飲水使其連續(xù)自由飲用7天以建立小鼠急性UC模型，造模的同時(shí)每天灌胃苦豆子總堿(75 mg/kg)進(jìn)行治療，根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)選擇苦豆子總堿最佳治療濃度[9]，并以柳氮磺胺嘧啶(450 mg/kg)為陽(yáng)性對(duì)照藥物，每天早晨更換新鮮DSS水溶液，小鼠灌胃體積均為0.015 mL/g。

1.6 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

實(shí)驗(yàn)期間每天記錄各組小鼠體重、糞便性狀及便血程度，疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1[17]。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The score scales for the disease activity index

1.7 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘眼球采血法收集血液于1.5 mL EP管中，室溫靜置2～3 h后3 000 rpm離心10 min，分離血清，存于-80 ℃?zhèn)溆?。采血后頸椎脫臼法處死小鼠，采集小鼠結(jié)腸并量取長(zhǎng)度，后分段采集各組小鼠結(jié)腸(結(jié)前、結(jié)后)、回腸以及肝臟組織(3份)，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。每組隨機(jī)抽取3只老鼠的結(jié)腸組織于10%甲醛溶液、中性甲醛固定液、多聚甲醛固定液中，分別用于蘇木精-伊紅(HE)染色、阿利新藍(lán)染色、過碘酸雪夫氏染色(schiff periodic acid shiff，PAS)。

1.8 HE染色法觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化

用結(jié)腸長(zhǎng)度以及組織學(xué)損傷來(lái)評(píng)估小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的治療情況和是否成功構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎模型。每組抽取3只小鼠結(jié)腸組織固定于10%甲醛溶液，后依次進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、后拍照(Leica DFC顯微拍照系統(tǒng))觀察結(jié)腸組織病變情況。組織病理學(xué)評(píng)分被用于量化結(jié)腸組織損傷程度，主要包括腸上皮細(xì)胞損傷程度和炎癥浸潤(rùn)程度兩個(gè)方面。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[17]。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The score scales for the colonic histopathology

1.9 糖原PAS、阿利新藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞

小鼠結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟至水依次自來(lái)水洗和蒸餾水洗；高碘酸氧化液10～20 min；蒸餾水洗2次；Schiff液染色10 min；流水沖洗5 min；蘇木素復(fù)染2～3 min；0.5%鹽酸乙醇分化；無(wú)水酒精、二甲苯透明，中性樹膠封固。采用濟(jì)南丹吉爾電子有限公司生產(chǎn)的Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織，選擇要觀察的區(qū)域采集400倍圖片，觀察具體表達(dá)情況。

1.10結(jié)腸組織中細(xì)胞因子的檢測(cè)

ELISA試劑盒檢測(cè)每組小鼠結(jié)腸中IL-10、IL-23、IL-17、IL-1β的含量，另取每組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定結(jié)腸中IL-10、IL-23、IL-17、IL-1β的含量。

1.11血清中總膽汁酸與總膽固醇的檢測(cè)

總膽固醇TCH試劑盒和總膽汁酸TBA試劑盒分別檢測(cè)每組小鼠中總膽固醇和總膽汁酸的含量。

1.12Westernblot法檢測(cè)小鼠肝臟組織和結(jié)腸組織蛋白的表達(dá)

取每組小鼠結(jié)腸前段組織和肝臟組織，分別稱重，結(jié)腸組織約0.025 0 g左右，肝臟組織約0.030 0 g左右，后剪碎以20 mg組織加200 μL RIPA高效裂解液的比例加入裂解液，后每個(gè)樣加入兩顆鐵珠子，再將每個(gè)樣放入冷凍型高通量組織研磨機(jī)充分裂解15～20 min，此過程均采用冰上操作，以提取蛋白。BCA法測(cè)定所得蛋白濃度，10%的SDS-PAGE分離蛋白，在此期間于分離膠第一孔加入PageRuler Prestained Protein Ladder用于參考，電泳1 h 30 min后采用0.22 μmPVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h，轉(zhuǎn)膜后在5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h，后將膜于以5%脫脂奶粉稀釋的一抗中4度孵育過夜，一抗兔多克隆抗體Rabbit Polyclonal Antibody：FXR/NR1H4(1∶1 000稀釋)、TGR5/GPBAR1(1∶1 000稀釋)、CYP7A1(1∶3 000稀釋)、beta Actin(1∶5 000稀釋)，一抗孵育結(jié)束后，TBST緩沖液洗膜(5 min一次，8～10次)，加入帶有HRP標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育1 h，二抗：HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)，二抗孵育結(jié)束后，TBST緩沖液洗膜(5 min一次，8～10次)，后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，于Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的信號(hào)采集與拍照，保存圖片，ImageJ軟件對(duì)每組圖片進(jìn)行灰度值分析。

1.13FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達(dá)與總膽汁酸、炎癥因子的相關(guān)性分析

采用SPSS 25.0軟件分析FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達(dá)與總膽汁酸、炎癥因子的相關(guān)性(Pearson)。R值=0.8～1.0極度相關(guān)，0.6～0.8強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6中等程度相關(guān)。

1.14統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析(one-way ANOVN)進(jìn)行組間比較，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，假設(shè)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠體重、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型成功復(fù)制，主要表現(xiàn)為便血腹瀉、體重下降、結(jié)腸縮短等明顯的臨床癥狀。給予小鼠DSS后第3天即可以看見糞便變軟，有少量出血，造模第6天除空白對(duì)照組其余組小鼠均開始嚴(yán)重的便血，且體重開始下降，DAI也持續(xù)升高，而苦豆子總堿治療組對(duì)體重下降和DAI升高有一定的抑制作用，第7天開始相比空白對(duì)照組，DSS誘導(dǎo)的模型組體重顯著降低(P<0.01)(見圖1A)，DAI顯著升高(P<0.01)(見圖1B)。造模后模型組小鼠較空白對(duì)照組結(jié)腸顯著縮短(P<0.01)，苦豆子總堿治療組能夠顯著增加結(jié)腸長(zhǎng)度(P<0.01)(見圖1C)，說明苦豆子總堿可以改善由潰瘍性結(jié)腸炎引起的小鼠結(jié)腸縮短。

圖1 苦豆子總堿對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Fig.1 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on body weight,disease activity index and colonic length in acute ulcerative colitis mice注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05 **P<0.01，下同。Note:Compared with Con,##P<0.01;Compared with DSS, *P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響及評(píng)分

HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化，由圖2可見，空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸鏡下結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛整齊排列，腸隱窩完整，杯狀細(xì)胞豐富，無(wú)炎癥，無(wú)組織學(xué)異常，DSS誘導(dǎo)的模型組腸絨毛脫落，結(jié)構(gòu)模糊，腸隱窩缺失，腸腺溶解，腸腺腺口打開，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有局部病變?cè)?，腸上皮增生，苦豆子總堿治療組和陽(yáng)性對(duì)照組均能不同程度改善炎癥引起的組織學(xué)改變，可見腸絨毛結(jié)構(gòu)恢復(fù)，腸腺分泌功能亢進(jìn)，炎性細(xì)胞被吸收，治療效果明顯(P<0.01)。

圖2 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響(HE，×200)Fig.2 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on colonic histopathology in acute ulcerative colitis mice(HE,×200)

2.3 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠杯狀細(xì)胞的影響

通過對(duì)小鼠結(jié)腸組織光鏡下觀察，確定PAS(見圖3A)和阿利新藍(lán)法(見圖3C)染色后杯狀細(xì)胞的數(shù)量，杯狀細(xì)胞分泌黏液(PAS染色陽(yáng)性)，對(duì)腸上皮有潤(rùn)滑和保護(hù)作用，PAS染色和阿利新藍(lán)染色均表現(xiàn)為DSS誘導(dǎo)的模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，但經(jīng)苦豆子總堿治療后杯狀細(xì)胞明顯增多(P<0.05)(見圖3B、D)。

圖3 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠杯狀細(xì)胞的影響(PAS和阿利新藍(lán)，×400)Fig.3 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on goblet cell in acute ulcerative colitis mice(PAS and Alcian blue,×400)

2.4 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠結(jié)腸中抗炎因子IL-10顯著降低(P<0.01)(見圖4A)，促炎因子IL-23、IL-17、IL-1β顯著升高(P<0.01)(見圖4B、D)，表明DSS造模后小鼠體內(nèi)有明顯的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，苦豆子總堿治療組IL-10一定程度的升高，表明治療后對(duì)抗炎因子有一定的正向調(diào)節(jié)作用，而苦豆子總堿治療組IL-23、IL-17、IL-1β顯著降低(P<0.01)，且苦豆子總堿治療組的促炎因子降低較陽(yáng)性對(duì)照組更明顯，要優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物的效果。表明經(jīng)苦豆子總堿治療后能顯著抑制促炎因子，對(duì)炎癥的發(fā)生有明顯的抑制作用。

圖4 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on colon cytokines in UC mice

2.5 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠血清中總膽汁酸與總膽固醇含量的影響

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠血清中總膽汁酸含量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)苦豆子總堿和陽(yáng)性對(duì)照藥治療后其含量都顯著降低(P<0.01)(見圖5A)，但苦豆子總堿治療組治療效果更優(yōu)。與空白對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠血清中總膽固醇含量降低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而苦豆子總堿和陽(yáng)性對(duì)照組膽固醇含量顯著升高(P<0.01)(見圖5B)。

圖5 苦豆子對(duì)急性UC小鼠血清中總膽汁酸與總膽固醇的影響Fig.5 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on serum TBA and T-CHO in UC mice

2.6 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠肝臟組織和結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠肝組織中FXR、TGR5、CYP7A1蛋白的表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)；與DSS誘導(dǎo)的模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中CYP7A1顯著升高(P<0.01)，苦豆子總堿治療組中CYP7A1變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苦豆子總堿治療組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中FXR和TGR5表達(dá)量有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6A～C)。

圖6 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠肝臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on the expression of related proteins in liver of acute UC mice

如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠結(jié)腸組織中FXR和CYP7A1蛋白的表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)，TGR5蛋白的表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DSS誘導(dǎo)的模型組相比，苦豆子總堿治療組小鼠結(jié)腸組織中FXR顯著升高(P<0.05)，CYP7A1和TGR5蛋白表達(dá)的變化雖有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖7A～C)。

圖7 苦豆子總堿對(duì)急性UC小鼠結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of total alkaloid from S.alopecuroides on the expression of related proteins in colon of acute UC mice

2.7 FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達(dá)與總膽汁酸、炎癥因子的相關(guān)性分析結(jié)果

FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達(dá)與總膽汁酸、炎癥因子的相關(guān)性結(jié)果見表3。由表3可知，結(jié)腸FXR、CYP7A1與總膽汁酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)r=-0.459，與IL-10呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),r=0.553；結(jié)腸TGR5與IL-1β、IL-23、IL-17呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),r=-0.450、-0.509、-0.407；肝臟FXR、TGR5、CYP7A1與IL-10呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),r=0.616、0.700、0.591。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 The results of correlation analysis

續(xù)表3(Continued Tab.3)

3 討論與結(jié)論

潰瘍性結(jié)腸炎UC是一種累及結(jié)腸及結(jié)腸黏膜的炎癥性腸病，因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在腸道內(nèi)蔓延區(qū)域廣、容易反復(fù)發(fā)作、且無(wú)特效藥、難以徹底治愈，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[18]。

本研究采用3.5%DSS誘導(dǎo)急性UC小鼠模型，相比其他造模方法，該方法操作簡(jiǎn)單，易于復(fù)制，適用于藥物療效以及作用機(jī)制的研究[19]。結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠便血嚴(yán)重，小鼠體重下降，DAI評(píng)分明顯上升，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，結(jié)腸組織病理學(xué)觀察黏膜脫落，隱窩消失，以上指標(biāo)表明本實(shí)驗(yàn)造模成功。經(jīng)過苦豆子總堿治療后，上述指標(biāo)均得到不同程度的改善，表明苦豆子總堿對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠模型有一定的治療作用。

已有研究表明，在許多腸道炎癥性疾病中，黏膜屏障功能的破壞，與大量細(xì)胞因子的釋放而引起的杯狀細(xì)胞和黏液層的損耗有關(guān)[20,21]，本實(shí)驗(yàn)采用PAS和阿利新藍(lán)特殊染色法觀察每組小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低，苦豆子總堿治療組數(shù)量明顯增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，炎性反應(yīng)具有促進(jìn)UC發(fā)生發(fā)展的作用，其中IL-17、IL-23、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子水平明顯升高，IL-10等抗炎因子水平明顯降低，導(dǎo)致促炎因子/抗炎因子失衡引起腸道炎性反應(yīng)[22]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)了細(xì)胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17的含量均顯著增加，苦豆子總堿治療組顯著降低；另外發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠抗炎因子IL-10含量顯著降低，苦豆子總堿治療組有所提升。以上結(jié)果表明苦豆子總堿可以通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)炎性因子以及杯狀細(xì)胞的含量，進(jìn)而起到抑制炎癥的作用，進(jìn)一步激活小鼠體內(nèi)的抗炎機(jī)制，從而改善結(jié)腸炎癥，達(dá)到治療效果。為臨床治療UC提供一定的理論依據(jù)和方法，但炎癥因子和杯狀細(xì)胞如何改善腸道黏膜屏障功能有待進(jìn)一步研究。

FXR、TGR5高表達(dá)于肝臟和結(jié)腸組織，參與體內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)，在調(diào)節(jié)炎癥、膽汁酸代謝、改善腸黏膜機(jī)械屏障、維持穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用[23]。李彥希等研究發(fā)現(xiàn)藏藥二十五味松石丸對(duì)肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能通過介導(dǎo) FXR 信號(hào)通路，調(diào)控其下游基因及下游蛋白，抑制膽汁酸過量分泌及合成，使膽汁酸的代謝趨于穩(wěn)態(tài)后改善膽汁淤積，而對(duì)膽汁酸的轉(zhuǎn)化過程無(wú)影響[23]。Wei等[24]研究表明FXR在UC患者結(jié)腸黏膜中的表達(dá)明顯下降，而TGR5表達(dá)無(wú)明顯差異，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符。有研究表明腸過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)-UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)信號(hào)是膽汁酸穩(wěn)態(tài)的重要決定因素。而在腸炎患者中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)被激活，細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的減少導(dǎo)致FXR-FGF15通路被抑制，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟CYP7A1的上調(diào)，從而促進(jìn)從頭開始的膽汁酸合成持續(xù)上升，打破了原有膽汁酸的穩(wěn)態(tài)[25]。FXR可通過誘導(dǎo)小分子異源二聚體伴侶(SHP)抑制CYP7A1負(fù)反饋調(diào)節(jié)膽汁酸的合成[26,27]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小鼠血清總膽固醇和總膽汁酸的含量，發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠總膽汁酸含量顯著升高，總膽固醇有所降低，苦豆子總堿治療組總膽汁酸含量顯著降低，總膽固醇含量顯著升高。WB結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟和結(jié)腸組織FXR、TGR5、CYP7A1均顯著下調(diào)，苦豆子總堿治療組肝臟組織中FXR、TGR5、CYP7A1有所上調(diào)但不顯著；結(jié)腸組織FXR顯著上調(diào)，TGR5和CYP7A1有所上調(diào)。以上結(jié)果提示UC小鼠體內(nèi)FXR、TGR5、CYP7A1的下調(diào)明顯加劇了炎癥的發(fā)生與發(fā)展，而苦豆子總堿可以激活結(jié)腸內(nèi)FXR表達(dá)，從而降低血清中總膽汁酸的含量，減輕由于膽汁酸堆積引起的炎癥，減輕其炎癥反應(yīng)，對(duì)UC起到一定的治療和保護(hù)作用。炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果提示，F(xiàn)XR也可能通過抑制促炎因子的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)。

FXR、TGR5、CYP7A1蛋白表達(dá)與總膽汁酸、炎癥因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，UC小鼠結(jié)腸組織FXR、CYP7A1與總膽汁酸均呈負(fù)相關(guān)，而與IL-10均呈正相關(guān)，TGR5與促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17均呈負(fù)相關(guān)，提示苦豆子總堿通過激活結(jié)腸FXR、TGR5、CYP7A1治療UC小鼠的同時(shí)其血清總膽汁酸含量和促炎因子含量降低，而抗炎因子IL-10含量升高，推測(cè)其可能通過促炎因子降低及抗炎因子IL-10的升高減輕炎癥反應(yīng)。與之前結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了苦豆子總堿治療潰瘍性結(jié)腸炎可能通過調(diào)控膽汁酸代謝途徑改善炎癥。此外，苦豆子總堿雖然對(duì)TGR5的激活有一定的上調(diào)作用但不明顯，其也有可能起到抑制炎癥的作用，有待進(jìn)一步的研究。

本研究通過給予 BALB/c小鼠3.5%DSS飲水使其連續(xù)自由飲用7天建立小鼠急性UC模型，評(píng)價(jià)并證實(shí)了苦豆子總堿能夠減少DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的組織損傷及炎癥癥狀?？喽棺涌倝A治療后血清總膽汁酸含量下降，結(jié)腸FXR、CYP7A1、TGR5蛋白均有不同程度的上調(diào)?？喽棺涌倝A可能通過增加小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞和抑炎因子IL-10的含量,降低促炎因子IL-23、IL-1β、IL-17含量,以及激活FXR/TGR5通路相關(guān)蛋白的表達(dá)治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。