周宇朦，孫洪浩，孫小涵，陳秀秀，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，遼寧沈陽(yáng)110127）

蛋白酶是一種能夠水解蛋白質(zhì)的生物催化劑，可以將蛋白質(zhì)水解為蛋白胨、多肽、游離氨基酸[1]；同時(shí)具有催化活性高、條件溫和、環(huán)保無(wú)污染、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，被廣泛應(yīng)用于畜牧、醫(yī)藥、食品、制革、污水處理等領(lǐng)域[5]。蛋白酶主要存在于植物莖葉及果實(shí)、動(dòng)物內(nèi)臟和微生物中[6]。

飼用蛋白酶可以改善動(dòng)物（尤其是幼齡）的生產(chǎn)性能、促進(jìn)內(nèi)源酶分泌及消化器官的發(fā)育[7-8]、降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子[9]、提高營(yíng)養(yǎng)的消化率[10]、提高機(jī)體免疫力[11]等，可作為綠色、安全、無(wú)污染的添加劑。蛋白酶可按最適反應(yīng)pH值的不同，分為堿性、中性和酸性蛋白酶[12]。全球工業(yè)酶銷售額約為37.4億，其中蛋白酶占60%，堿性蛋白酶占25%[13-17]。蛋白酶在原料資源緊張、成本上漲的畜牧飼料行業(yè)中發(fā)揮著巨大的作用[18]。為了解不同堿性蛋白酶產(chǎn)品的差異性，本研究對(duì)多種堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較，為堿性蛋白酶在畜牧業(yè)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堿性蛋白酶由不同廠家提供的5種堿性蛋白酶，分別命名為A、B、C、D、E。

1.2 試驗(yàn)試劑

福林試劑、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、四硼酸鈉、干酪素、L-酪氨酸、三氯乙酸等。其中L-酪氨酸是生物試劑，其余均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

CP2102電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）、FiveEasy Plus pH計(jì)（梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司）、HJ-6A數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器（常州金壇良友儀器有限公司）、TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）、752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白酶活性測(cè)定

參考GB/T 23527—2009進(jìn)行蛋白酶活性檢測(cè)（福林法）。

1.4.2 蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.4.2.1 最適反應(yīng)溫度

將蛋白酶反應(yīng)體系的溫度分別調(diào)整為20、30、40、50、60、70℃，進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后計(jì)算相對(duì)酶活性（最高酶活設(shè)為100%）。

1.4.2.2 熱穩(wěn)定性

將蛋白酶分別放在40、60、80、100℃的水浴鍋中孵育，每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)酶活（最高酶活設(shè)為100%）。

1.4.2.3 最適反應(yīng)pH值

將酶反應(yīng)體系的pH值分別調(diào)整為7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5，進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)酶活（最高酶活設(shè)為100%）。

1.4.2.4 pH值穩(wěn)定性

將蛋白酶分別放在不同的pH值（7.5～12.5）環(huán)境中，25℃孵育1 h，取樣進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)酶活（最高酶活設(shè)為100%）。

1.4.2.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

在蛋白酶稀釋液中分別加入10 mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+和Co2+溶液，25℃孵育1 h，進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)酶活（未加金屬離子酶活設(shè)為100%）[19]。

1.4.2.6 化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

在蛋白酶稀釋液中分別加入5 mmol/L SDS、10 mmol/L SDS、2 mol/L EDTA和4 mol/L尿素，25℃孵育1 h，進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算相對(duì)酶活（未加化學(xué)試劑酶活設(shè)為100%）[20]。

1.4.2.7 堿性蛋白酶對(duì)胃-胰蛋白酶的耐受性

取1 mL稀釋酶液，加50 mL pH值2.50的HCl緩沖液，取出2.25 mL混合液，加入2.25 mL的5 g/L胃蛋白酶，37℃溫育1.5 h。取出2.25 mL混合液，調(diào)節(jié)pH值至6.50，再加入2.25 mL的5 g/L胰蛋白酶，37℃溫育4 h，取適量處理液，稀釋，在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)條件下檢測(cè)酶活，計(jì)算相對(duì)酶活（未處理組酶活設(shè)為100%）[21]。

1.4.2.8 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

研究酶促反應(yīng)的速率以及底物濃度對(duì)速率的影響。配置不同濃度的底物溶液（1.25～15.00 g/L），進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算酶活力。使用雙倒數(shù)作圖法，橫坐標(biāo)為1/底物濃度，縱坐標(biāo)為1/ν。由此信息做出的二元一次方程，與橫軸截距是負(fù)的米氏常數(shù)的倒數(shù)，與縱軸截距是酶促反應(yīng)最大速度的倒數(shù)[22]。

Km值是酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度，是酶的特征常數(shù)。Km大小只與酶自身的性質(zhì)有關(guān)，不同的酶Km值不同，同一種酶與不同底物反應(yīng)Km值也不同[23]。Km值越小，達(dá)到最大反應(yīng)速率一半所需要的底物濃度就越小，酶與底物的親和力越好，這個(gè)底物被叫為最適底物。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)，使用Origin 75軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度（見(jiàn)圖1）

由圖1可知，酶A、B、C和E的最適反應(yīng)溫度均是60℃，酶D的最適反應(yīng)溫度是50℃。

圖1 堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度Fig.1 Optimal reaction temperature of alkaline protease

2.2 堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性（見(jiàn)圖2）

將5種堿性蛋白酶在40℃孵育5 h，每隔1 h取樣測(cè)定酶活力。由圖2（a）可知，0～1 h酶活損失較小，1～3 h酶D和酶E酶活損失較小，3～5 h只剩酶D還剩有較高酶活，其他酶活下降明顯。因此，酶D的熱穩(wěn)定最好，總體熱穩(wěn)定性為D＞E＞B＞C＞A。

將5種堿性蛋白酶在60℃孵育5 h，每隔30 min取樣測(cè)定酶活力。由圖2（b）可知，0～1 h酶活迅速降低，1～5 h降低速度趨于平緩，最后完全失活。

將5種堿性蛋白酶在80℃孵育60 s，每隔15 s取樣測(cè)定酶活力。由圖2（c）可知，0～30 s損失一半酶活，30～45 s迅速損失剩余酶活，45～60 s損失速度降慢，最后完全失活。

將5種堿性蛋白酶在100℃孵育40 s，每隔10 s取樣測(cè)定酶活力。由圖2（d）可知，0～10 s損失三分之一酶活，10～30 s迅速損失剩余酶活，30～40 s損失速度降慢，最后完全失活。

圖2 堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of alkaline protease

2.3 堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值（見(jiàn)圖3）

由圖3可知，酶的最適反應(yīng)pH值均為10.5，符合堿性蛋白酶的特點(diǎn)。

圖3 堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值Fig.3 Optimal reaction pH of alkaline protease

2.4 堿性蛋白酶的pH值穩(wěn)定性（見(jiàn)圖4）

由圖4可知，酶A、C、D和E在pH值7.5～12.5時(shí)酶活穩(wěn)定，相對(duì)酶活在79%以上；酶B在pH值7.5～10.5時(shí)酶活穩(wěn)定，在pH值10.5～12.5時(shí)酶活下降到40%以下。

圖4 堿性蛋白酶的p H值穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of alkaline protease

2.5 金屬離子對(duì)堿性蛋白酶活性的影響（見(jiàn)圖5）

由圖5可知，金屬離子主要對(duì)酶A、C和E起抑制作用，對(duì)酶B和D起激活作用，其中Cu2+對(duì)酶的抑制作用顯著，使酶活低于25%，其他金屬離子對(duì)酶活影響不顯著，使酶活在80%～120%之間變化。

圖5 金屬離子對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on activity of alkaline protease

2.6 化學(xué)試劑對(duì)堿性蛋白酶活性的影響（見(jiàn)圖6）

由圖6可知，EDTA對(duì)酶A有抑制作用，尿素對(duì)酶E有抑制作用，其他化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響不大或者無(wú)影響。

圖6 化學(xué)試劑對(duì)堿性蛋白酶的影響Fig.6 Effect of chemical reagents on alkaline protease

2.7 胃-胰蛋白酶對(duì)堿性蛋白酶活性的影響（見(jiàn)圖7）

由圖7可知，5種酶對(duì)胃-胰蛋白酶的耐受性均不好，經(jīng)處理后5種酶的相對(duì)酶活均降低到20%以下。

圖7 胃-胰蛋白酶對(duì)堿性蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of gastric-trypsin on activity of alkaline protease

2.8 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（見(jiàn)圖8）

由圖8可知，利用雙倒數(shù)作圖法得到酶A的最大反應(yīng)速率νmax=0.79 g/min，Km=9.09；酶B的最大反應(yīng)速率νmax=1.75 g/min，Km=33.33；酶C的最大反應(yīng)速率νmax=0.07 g/min，Km=3.45；酶D的最大反應(yīng)速率νmax=0.05 g/min，Km=4.35；酶E的最大反應(yīng)速率νmax=0.09 g/min，Km=8.33。

圖8 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.8 Enzymatic reaction kinetics curve

3 討論

酶制劑在飼料中的使用以及作用效果受酶制劑的種類、添加方式、添加量等多種因素影響[24]。目前對(duì)酶制劑的研究有限，并不能完全掌握酶制劑的作用機(jī)制。不同的學(xué)者研究得出不同的結(jié)果，所以酶制劑在飼料應(yīng)用中還存在限制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酶A、B、C和E的最適反應(yīng)溫度均是60℃，酶D的最適反應(yīng)溫度是50℃。因?yàn)槊傅谋举|(zhì)是蛋白質(zhì)，適宜的溫度有利于酶促反應(yīng)，超出酶耐受范圍的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性[22]。5種堿性蛋白酶在40℃時(shí)熱穩(wěn)定性最好，溫度升高后，幾秒后酶活迅速降為零，因此這5種堿性蛋白酶均不適合制粒加工，因?yàn)轱暳现屏囟雀哌_(dá)80℃。單純考慮溫度，5種酶適合在畜禽的腸道中使用，最適合的是酶D，因?yàn)槟c道溫度約40℃[20]。5種堿性蛋白酶的最適pH均為10.50，并在堿性條件下穩(wěn)定，符合堿性蛋白酶在中性或堿性環(huán)境中高活力的特征，但不能在pH值2.2～3.5的禽胃和pH值5.0～7.0的小腸中長(zhǎng)時(shí)間停留[21]。

酶制劑在儲(chǔ)存和應(yīng)用過(guò)程中，會(huì)添加或接觸一些金屬離子，這些金屬離子會(huì)對(duì)蛋白酶的酶活力產(chǎn)生一定的影響。本研究中，K+對(duì)其中4種酶均有輕微抑制作用，而柴金龍等[25]研究表明，K+對(duì)重組蛋白酶OSP有強(qiáng)力促進(jìn)作用。Na+對(duì)酶活幾乎無(wú)影響，與蔡恒博[22]的研究結(jié)果相似。Cu2+對(duì)5種酶均有強(qiáng)烈抑制作用，而陳琳[26]研究表明，Cu2+對(duì)低溫蛋白酶有明顯激活作用。本研究中，Mn2+對(duì)其中3種酶有抑制作用；Ca2+對(duì)其中3種酶有促進(jìn)作用；Zn2+對(duì)其中4種酶有抑制作用；Mg2+對(duì)其中2種酶有促進(jìn)作用；Co2+對(duì)其中3種酶有抑制作用。陳琳[26]研究表明，Mn2+激活低溫蛋白酶酶活，F(xiàn)e3+抑制酶活，Ca2+、Zn2+、Mg2+、Co2+對(duì)酶活力影響較小或無(wú)明顯影響。Gupta等[27]研究表明，Ca2+對(duì)耐有機(jī)溶劑蛋白酶有抑制作用。Uttatree等[28]和柴金龍等[25]研究表明，Mg2+對(duì)耐有機(jī)溶劑蛋白酶和重組蛋白酶OSP有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中，化學(xué)試劑對(duì)酶活有不同的影響，對(duì)胃-胰蛋白酶耐受性差，再次證明5種堿性蛋白酶不適合長(zhǎng)時(shí)間存在于動(dòng)物體內(nèi)。

飼用酶制劑作為高效、綠色的外源添加劑，能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。要大力發(fā)展飼用酶制劑的新結(jié)構(gòu)，向規(guī)范化、精細(xì)化、安全化看齊，做到促消費(fèi)、穩(wěn)就業(yè)、服三農(nóng)[29]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)涉及的5種堿性蛋白酶，最適反應(yīng)溫度有4種相同，熱穩(wěn)定性不同，最適反應(yīng)pH值相同，對(duì)pH值的耐受性不同，受金屬離子和化學(xué)試劑的影響不同，對(duì)胰-胃蛋白酶的耐受性均較差，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)不相同。綜上所述，不同的堿性蛋白酶有著不同的酶學(xué)特性，應(yīng)用時(shí)要選擇適合的，發(fā)揮最大酶效應(yīng)。