翟文漢，宮 強(qiáng)，李雅靜

（河南科技大學(xué)，河南洛陽471023）

銅綠假單胞菌引起禽類、水貂等多種動(dòng)物發(fā)生化膿性肺炎、菌血癥、敗血癥、心內(nèi)膜炎及呼吸系統(tǒng)感染等疾病，給畜牧業(yè)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-6]。目前，該病的治療主要依靠抗生素，但隨著近年來該菌耐藥性的日益嚴(yán)重，使抗生素治療的效果降低，需要采取更加有效的預(yù)防和治療手段。疫苗免疫是預(yù)防傳染性疾病的有效策略之一，但傳統(tǒng)的減毒疫苗和滅活疫苗在效力、安全效用方面存在著許多缺點(diǎn)。臨床上無針對(duì)銅綠假單胞菌感染的商品化疫苗。因此，研制新型有效疫苗對(duì)預(yù)防和控制該病具有重要的意義。本研究以銅綠假單胞菌外膜蛋白o(hù)prD編碼基因?yàn)槟康幕颍瑯?gòu)建了其重組原核表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)與純化，為其基因工程亞單位疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銅綠假單胞菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21（DE3）以及原核表達(dá)載體pET32a為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成與基因測序由上海生工生物工程有限公司完成。Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I、T-Vector pMD?19、高分子量蛋白Marker、DNA Marker DL10000及DL2000 Marker，均購自Takara公司。蛋白電泳制備試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Ni-IDA蛋白純化試劑盒和膠回收試劑盒，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的銅綠假單胞oprD基因全序列及原核表達(dá)載體pET32a多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增該基因的特異性引物，上下游分別含有BamH I、Xho I位點(diǎn)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。序列為D-U：5'-CGGGATCCATGAAAGTGATGAAGTG GAGCGC-3'，D-L：5'-CCCTCGAGTTACAGGATCGACA GCGGATAGTCGA-3'。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因的擴(kuò)增與純化

采用CTAB法提取銅綠假單胞菌的基因組DNA。以提取的基因組為模板，以上、下游引物對(duì)oprD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系含ddH2O 9.5μL、Taq Mix DNA聚合酶12.5μL、模板DNA 1μL、10μmol/L的上下游引物各1μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、67℃退火30 s、72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min，4℃保溫。PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測PCR擴(kuò)增片段的大小，以膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以T4 DNA連接酶將上述回收純化后的oprD基因的PCR產(chǎn)物與T-Vector pMD?19共同在16℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取菌落，抽提質(zhì)粒，以BamH I/Xho I雙酶切鑒定。取陽性重組質(zhì)粒以BamH I/Xho I雙酶切獲得oprD基因片段，與同樣經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切處理的原核表達(dá)載體pET32a以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB平板中，挑菌提質(zhì)粒，再次以上述兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pET32a-oprD。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

制備大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，取1μL pET32a-oprD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入該感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，移入含50 mg/L氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。次日取50μL菌液移入5 mL新鮮的含50 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床37℃、220 r/min增菌，每隔1 h檢測1次OD600nm值，當(dāng)OD600nm值達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h。取誘導(dǎo)后的菌液1 mL，6 000 r/min離心5 min，棄掉上清，使用pH值7.2的1×PBS漂洗，重懸沉淀，加入2×蛋白電泳上樣緩沖液振蕩混勻，煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色，觀察結(jié)果。

1.3.4 OPRD重組蛋白最佳表達(dá)條件的優(yōu)化

為優(yōu)化OPRD重組蛋白的最佳表達(dá)條件，將含pET32a-oprD質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液按上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)，分別探索誘導(dǎo)前的培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)效果的影響，具體優(yōu)化參數(shù)見表1。誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行SDS-PAGE分析，以Image Lab軟件分析不同泳道的相對(duì)表達(dá)量，確定最佳表達(dá)條件。

表1 OPRD重組蛋白的最佳表達(dá)條件的優(yōu)化Tab.1 Optimization of the optimal expression of oprD recombinant protein

1.3.5 重組蛋白的分離純化

按照上述最佳表達(dá)條件對(duì)工程菌誘導(dǎo)，離心收集沉淀，加入tritonx-100緩沖液進(jìn)行重懸后以超聲波破碎儀進(jìn)行破碎處理，離心獲得上清液，利用Ni-IDA蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因oprD的PCR擴(kuò)增結(jié)果（見圖1）

圖1銅綠假單胞菌oprD基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of oprD gene of Pseudomonasaeruginosa

由圖1可知，擴(kuò)增獲得約1 340 bp的特異性片段，與預(yù)期大小一致。

2.2 重組表達(dá)載體pET32a-oprD酶切鑒定結(jié)果（見圖2）

圖2 重組表達(dá)載體的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Electrophoresis of double digestion of pET32a-oprD

由圖2可知，雙酶切后獲得約1 340 bp的條帶，與目的基因大小一致，表明重組質(zhì)粒pET32a-oprD構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，電泳圖譜中可以發(fā)現(xiàn)重組目的蛋白的表達(dá)，分子量約65 kD，與預(yù)期大小一致，表明成功實(shí)現(xiàn)了OPRD重組蛋白在大腸桿菌中的正確表達(dá)。

圖3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of OPRD recombinant protein

2.4 最佳培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖4）

將含pET32a-oprD質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液分別培養(yǎng)2.5～6.0 h，加入1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。由圖4可知，經(jīng)Image Lab分析顯示，菌液培養(yǎng)5 h后進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量最高。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of recombinant protein induced by different incubation time

2.5 IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果（見圖5）

將含pET32a-oprD質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液培養(yǎng)5 h，分別加入終濃度為0.4～1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。由圖5可知，Image Lab分析表明，加入IPTG至終濃度為0.7 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高。

圖5 不同IPTG濃度下誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of expression of recombinant protein induced by different IPTG concentrations

2.6 最佳誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果（見圖6）

將含pET32a-oprD質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液培養(yǎng)5 h，加入終濃度0.7 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別誘導(dǎo)3～6 h，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。由圖6可知，Image Lab分析顯示，誘導(dǎo)時(shí)間為4.5 h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間下重組蛋白誘導(dǎo)的表達(dá)結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE of expression of recombinant protein was induced by different induction time

2.7 重組蛋白分離純化結(jié)果（見圖7）

圖7 重組蛋白的分離純化結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE of separation and purification of recombinant protein

按照最佳表達(dá)條件對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖7可知，獲得分子量約65 kD的較純的特異性目的蛋白。

3 討論

銅綠假單胞菌在所有耐抗生素革蘭陰性菌中居于首位。對(duì)銅綠假單胞菌疫苗的研究報(bào)道不少，包括傳統(tǒng)疫苗，如滅活疫苗、結(jié)合疫苗、重組亞單位疫苗等新型疫苗[7-9]。外膜蛋白是銅綠假單胞菌重要的保護(hù)性抗原。外膜蛋白對(duì)該病原菌的生長繁殖、環(huán)境適應(yīng)、致病性及耐藥性均起到至關(guān)重要的作用。由于不同血清型銅綠假單胞菌的外膜蛋白具有高度的一致性，因此外膜蛋白是理想的銅綠假單胞菌疫苗候選分子。在銅綠假單胞菌的外膜中至少存在D、E、F、G、H等16種外膜蛋白[10]。其中，OPRD是銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要介質(zhì)，與細(xì)菌的耐藥性關(guān)系密切[11-13]。Epp等[14]使用MalE-OprD融合蛋白制劑免疫新西蘭大白兔，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體能產(chǎn)生針對(duì)OPRD蛋白的特異性抗體，表明該蛋白具有免疫原性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌液培養(yǎng)5 h后添加IPTG誘導(dǎo)劑，重組蛋白的表達(dá)量最高，可能因?yàn)榕囵B(yǎng)5 h時(shí)，菌體處于對(duì)數(shù)生長期，濃度較高，生長代謝能力強(qiáng)，蛋白合成旺盛，加入誘導(dǎo)劑利于菌體大量表達(dá)獲得OPRD蛋白，而繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)菌體活力下降，目的蛋白表達(dá)量降低[15]。IPTG對(duì)細(xì)菌有一定的毒性，高濃度的IPTG抑制細(xì)菌的生長，影響蛋白的表達(dá)，與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的較低濃度IPTG利于蛋白的表達(dá)相符[16]。本試驗(yàn)成功對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，獲得較純的OPRD重組蛋白。本試驗(yàn)為銅綠假單胞菌OPRD蛋白功能的研究及其相關(guān)診斷試劑和疫苗的研制提供參考。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功擴(kuò)增銅綠假單胞菌1 340 bp的oprD基因片段，成功表達(dá)了65 kD的OPRD重組蛋白。探索出該蛋白的最佳表達(dá)條件為誘導(dǎo)前工程菌培養(yǎng)5 h、IPTG終濃度0.7 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間4.5 h。經(jīng)鎳柱蛋白純化試劑盒獲得了純度較高的OPRD重組蛋白。