魏軒輝

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽(yáng) 471000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，在女性癌因性死亡中，宮頸癌居第二位[1,2]。目前針對(duì)宮頸癌仍缺乏特異性的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物，盡管鱗狀上皮細(xì)胞抗原（Cervical Squamous Cell Carcinoma，SCCA）在宮頸癌的診斷及預(yù)后評(píng)估中具有重要作用，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其診斷特異性較低，部分皮膚疾病、食道疾病、乳腺疾病患者也會(huì)出現(xiàn)SCCA 升高造成假陽(yáng)性診斷的情形[3,4]。因此尋找與宮頸癌診斷及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物成為亟待解決的問(wèn)題。已有文獻(xiàn)[5]報(bào)道磷脂酰肌醇-3 激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能參與調(diào)節(jié)乳腺腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于PIK3R1在宮頸癌中表達(dá)情況及其與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不完全清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)PIK3R1在宮頸癌患者的表達(dá)情況，旨在為宮頸癌的診斷及預(yù)后評(píng)估尋找分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年6 月-2017年6 月本院收治的60例行手術(shù)治療的宮頸癌患者的病理組織標(biāo)本（CC 組），年齡29～78（51.84±9.42）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）宮頸癌分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)病理確診為宮頸癌；⑵術(shù)前無(wú)放療和化療史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的患者；⑵合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙者；⑶隨訪資料不完整者。另收集同期與宮頸癌患者年齡匹配的42例因良性疾病切除的新鮮宮頸組織為對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 查閱病歷記錄采集宮頸癌患者年齡、病理類型、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理分級(jí)等臨床資料；所有患者術(shù)后隨訪觀察3年，術(shù)后隨訪以電話及門(mén)診方式進(jìn)行,記錄患者隨訪期內(nèi)生存情況，總生存率（overall survival，OS）計(jì)算終點(diǎn)為各種因素導(dǎo)致的死亡。

1.2.2 組織標(biāo)本中PIK3R1基因檢測(cè) 采用qRTPCR 法檢測(cè)，參照Trizol 試劑（日本TaKaRa 公司）說(shuō)明書(shū)從組織樣本中提取總RNA，提取的總RNA以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（瑞士羅氏）合成cDNA，反應(yīng)條件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。參照Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因mRNA 序列委托上海生工進(jìn)行PIK3R1及GAPDH引物設(shè)計(jì)合成。使用GAPDH 作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，采用全自動(dòng)熒光定量PCR 分析儀（羅氏cobas z480）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PIK3R1 相對(duì)表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法計(jì)算PIK3R1基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 PIK3R1 編碼蛋白（p85α蛋白）檢測(cè) 采用免疫組化檢測(cè)，石蠟包埋的組織標(biāo)本4μm 連續(xù)切片，使用二甲苯連續(xù)脫蠟3 次，梯度乙醇脫二甲苯，水洗。3%過(guò)氧化氫室溫孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；然后以10mmol/L 檸檬酸鈉/胃酶修復(fù)液進(jìn)行熱抗原修復(fù)。冷卻后滴加兔抗人p85α多克隆抗體（上海生工）,4℃孵育過(guò)夜,復(fù)溫0.5～1h 后，PBS沖洗3 次，滴加二抗工作液，37 孵育20min 后，PBS沖洗3 次，采用DAB 顯色，嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，常規(guī)脫水、封片。使用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 替代p85α 一抗作為陰性對(duì)照。分別在4 個(gè)隨機(jī)高倍視野(×400)下對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并取其平均值。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)切片視野（×200），采用Image J 軟件分析顯微鏡下細(xì)胞分布情況。判定標(biāo)準(zhǔn)：p85α 分布于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，以胞漿或胞核出現(xiàn)巧克力樣染色為陽(yáng)性細(xì)胞。以細(xì)胞核染色強(qiáng)度結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)p85α表達(dá)情況進(jìn)行判讀，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比并賦予分值，0%計(jì)為0分，～10%為1 分，～30%為2 分，～50%計(jì)3 分，50%及以上計(jì)4 分；觀察染色強(qiáng)度并賦予分值，無(wú)色計(jì)0 分，淺棕色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，巧克力色計(jì)3分。以上兩項(xiàng)分值乘積＜3 分為陰性（-），≥3 分為陽(yáng)性（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，使用t 檢驗(yàn)比較；計(jì)數(shù)資料采用率表示，采取χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier 法，并使用Log-rank 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均采取雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PIK3R1表達(dá)比較 CC 組PIK3R1基因表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；p85α蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，CC 組p85α 陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1和圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)PIK3R1基因編碼蛋白（p85α）表達(dá)

表1 兩組PIK3R1基因及其編碼蛋白p85α表達(dá)比較

2.2 宮頸癌癌組織中p85α蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 p85α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、病理類型和病理分級(jí)無(wú)關(guān)（P>0.05）,與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期患者p85α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p85α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 宮頸癌癌組織中p85α蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌癌組織p85α蛋白表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 本研究觀察期內(nèi)，60例宮頸癌患者共有27例（45.0%）死亡，p85α蛋白陽(yáng)性組實(shí)際生存率（77.78%，14/18）明顯高于p85α蛋白陰性組（45.24%，19/42）（P<0.05）。進(jìn)一步使用Kaplan-Meier 生存曲線分析宮頸癌患者生存資料，p85α蛋白陽(yáng)性組整體生存情況優(yōu)于p85α蛋白陰性組（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 p85α 陽(yáng)性、陰性宮頸癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

3 討論

P13K/mTOR/AKT通路異常激活與腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其通過(guò)影響細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及代謝等生物過(guò)程[7]。研究指出[8]，宮頸癌存在P13/mTOR/AKT通路異常激活現(xiàn)象。磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol -3-kinase，PI3K）作為是磷脂激酶家族成員，是多個(gè)亞基組成的多聚體，主要發(fā)揮催化底物的作用，可將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)來(lái)產(chǎn)生一系列胞內(nèi)反應(yīng)，并由Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類亞基執(zhí)行不同功能[9]。研究已證實(shí)抗腫瘤藥物可抑制P13K 信號(hào)通路活性來(lái)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，P13K的靶向抑制劑也正在逐漸走向臨床試驗(yàn)階段[10]。PIK3R1則是PI3K的調(diào)節(jié)亞基之一，多個(gè)研究[11,12]證實(shí)在惡性腫瘤疾病中存在PIK3R1 突變及異常表達(dá)。本研究也顯示，CC 組PIK3R1基因表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；這與往期報(bào)道結(jié)論相符[13]，均證實(shí)PIK3R1基因表達(dá)與惡性腫瘤疾病存在顯著關(guān)聯(lián)。

PIK3R1基因突變位于其編碼蛋白p85α蛋白的iSH2 區(qū)，p85α蛋白可發(fā)揮穩(wěn)定p110 亞基、抑制p110 酶活性、招募磷酸化的絡(luò)氨酸殘基等作用[14]。研究指出，PIK3R1基因突變雖仍可保持結(jié)合、穩(wěn)定p110 催化亞基的能力，但其抑制p110 活性的能力下降，從而促進(jìn)P13K 活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[15]。Chen 等[16]指出p85α蛋白在乳腺癌的表達(dá)缺失促使PI3K 信號(hào)增加，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體組織癌變[16]，但其在CC 中的臨床研究仍有待補(bǔ)充。本研究顯示，p85α蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，CC 組p85α 陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組，提示PIK3R1 編碼蛋白p85α與CC 存在關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步比較不同臨床特征的CC患者p85α蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示FIGO 分期Ⅲ、Ⅳ期患者p85α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p85α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。由此可見(jiàn)，宮頸癌癌組織中p85α表達(dá)缺失可能與宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。往期研究報(bào)道，p85α 可與p110 類催化亞基形成異源二聚體，當(dāng)無(wú)外源信號(hào)刺激時(shí)，p85與p110 結(jié)合來(lái)抑制p110 酶活性，在受體絡(luò)氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）活化后，Ⅰ類P13K 亞基可被招募至細(xì)胞膜附近，此時(shí)p85對(duì)p110的抑制作用解除，p110 催化PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3，PIP3 再作為第二信使將信號(hào)繼續(xù)向下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而影響腫瘤疾病侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究分析了所有入選宮頸癌患者的隨訪生存資料，發(fā)現(xiàn)p85α 陽(yáng)性表達(dá)組整體生存情況優(yōu)于陰性表達(dá)組，預(yù)后相對(duì)更好，進(jìn)一步證實(shí)PIK3R1表達(dá)缺失宮頸癌患者預(yù)后有密切關(guān)系，提示PIK3R1及其編碼蛋白p85α 可能是一種新的宮頸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，其具體的分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PIK3R1在宮頸癌異常表達(dá)，宮頸癌癌組織中PIK3R1表達(dá)缺失可能預(yù)示著宮頸癌癌分期晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良。