李馳坤，靳宏光，成光宇，歐喜燕，丁云錄，李曉兵

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）近些年來(lái)發(fā)病概率逐年升高，已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康安全的疾病。隨著人們生活水平逐漸提升，人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，生活品質(zhì)的提高，高鹽高脂、缺乏運(yùn)動(dòng)的飲食與生活習(xí)慣使人們的血糖、血脂等指標(biāo)嚴(yán)重超標(biāo)，對(duì)心血管的損害越來(lái)越大，患病年齡也呈年輕化趨勢(shì)。中醫(yī)并無(wú)“冠心病”病名，依據(jù)患者的臨床癥狀和特征改變，眾多醫(yī)家認(rèn)為冠心病中的穩(wěn)定型冠心病歸于“胸痹心痛”范圍，根據(jù)中醫(yī)理論，屬于以氣、血、陰、陽(yáng)虛衰，以至于“君主之官”失于溫養(yǎng)為本，以寒凝、氣滯、血瘀、痰濁等痹阻心陽(yáng)、阻滯心脈為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)的證候，主要證候要素可以分為氣虛血瘀、氣滯血瘀、氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)等[1-2]。冠心病的主要單一證素包括寒凝證、血瘀證兩種[3]，其中，寒凝血瘀證該復(fù)合因素，是冠心病心絞痛的證候分布組成中的主要部分[4]。

由于人的特殊性，我們無(wú)法直接在人體上進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。因此，在病證的模擬建型中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就成為首要選擇[5]。楊雙杰[6]應(yīng)用高脂飼料和冠脈結(jié)扎結(jié)合的方式，喂養(yǎng)和處置自發(fā)性高血壓大鼠，成功制備出高血壓合并高血脂符合心梗的動(dòng)物模型。王麗云[7]等采用豚鼠構(gòu)建寒飲伏肺的慢性咳嗽模型，先應(yīng)用環(huán)磷酰胺對(duì)豚鼠進(jìn)行免疫抑制，再應(yīng)用卵蛋白和氫氧化鋁誘發(fā)致敏，接著在寒冷條件下進(jìn)行冷食喂養(yǎng)。經(jīng)檢測(cè)豚鼠的咳嗽頻繁，氣道阻力明顯升高，肺組織病理學(xué)檢測(cè)符合寒飲伏肺證表現(xiàn)，確認(rèn)該模型制備成功。李海洋等[8]發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的GK 大鼠明顯存在糖尿病的臨床癥狀，另外糖尿病大血管病變的出現(xiàn)和高脂飲食關(guān)系密切，因此，采用了自發(fā)形成糖尿病和高脂飲食誘導(dǎo)結(jié)合的方法，制備出具有“氣陰兩虛”特點(diǎn)的大鼠模型。由此可展開(kāi)大規(guī)模的基礎(chǔ)研究，探究疾病的產(chǎn)生及發(fā)展機(jī)制，以及制訂有效防治辦法，還可對(duì)防治措施進(jìn)行檢驗(yàn)，不斷重復(fù)，不時(shí)優(yōu)化，最終取得最佳治療方案。由此可見(jiàn)，動(dòng)物可以代替人們作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。且在人為的特定條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)[9]。但對(duì)于目前動(dòng)物模型的創(chuàng)建仍與臨床上的病證有著一定的差距，因此，本項(xiàng)目嚴(yán)格依據(jù)中醫(yī)對(duì)于胸痹心痛證寒凝血瘀證病因病機(jī)認(rèn)識(shí)，在以往的研究基礎(chǔ)上，采取高脂飲食喂養(yǎng)、垂體后葉素制造缺血和寒冷因素刺激聯(lián)合的方法進(jìn)行模型構(gòu)建，最終建立盡可能合乎臨床的寒凝血瘀證的大鼠模型。通過(guò)高脂飲食飼養(yǎng)大鼠，是構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型重要的方法之一[10]。在結(jié)合中醫(yī)典籍的指導(dǎo)下進(jìn)行造模，這樣得出的模型也更加契合中醫(yī)學(xué)中寒凝血瘀證病因病機(jī)的特點(diǎn)，更充分地反映該疾病的本質(zhì)，并能夠從模型動(dòng)物的體征、電生理學(xué)、血液生化學(xué)和病理學(xué)等多層次對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 根據(jù)不同的模型的建立，選擇相適應(yīng)的動(dòng)物來(lái)建立模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要[11]。選用正常的雄性SD 大鼠SPF 級(jí)40 只，體質(zhì)量（230 g±20）g，大鼠由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（吉）2018-0007。

1.2 試劑與儀器 垂體后葉素注射液（6 U/2 mL，上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào) 160301）、1%戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20111110），TXB2酶免試劑盒（美國(guó) R&D Systems Inc，批號(hào) 20191002B），6-Keto-PGF1α酶免試劑盒（美國(guó) R&D Systems Inc，批號(hào) 20191002B）。Powerlab/8sp生理信號(hào)收集系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司），MC-142L歐姆龍電子體溫計(jì)（歐姆龍大連有限公司），BIO680酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），Biofuge Stratos 臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國(guó)賀利氏公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將SD 大鼠分為對(duì)照組和模型組（寒凝血瘀證組），各20 只。

2.2 造模方法 將模型組大鼠分別獨(dú)立裝入小籠內(nèi)，置于帶有玻璃蓋的低溫冰柜內(nèi)，溫度為-15℃，持續(xù)放置1 h，之后再返回至20℃室溫，如此反復(fù)6 周時(shí)間，于第5 周第5 天給予垂體后葉素20 U/kg 腹腔注射，每日1 次，連續(xù)3 d。常規(guī)對(duì)照組在同樣的室溫條件下正常喂養(yǎng)。

2.3 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法 待上述實(shí)驗(yàn)完成后，再予2 組大鼠的腹腔內(nèi)推注1%戊巴比妥鈉0.05 mL/kg，等大鼠徹底麻醉了以后，再檢測(cè)如下指標(biāo)。

2.3.1 肛溫 將電子體溫計(jì)緩慢地插進(jìn)到大鼠肛門(mén)約2 cm 處，等到數(shù)值穩(wěn)定以后，再讀取數(shù)據(jù)。

2.3.2 心電圖 記錄模型組造模后30 min 內(nèi)標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以J 點(diǎn)（QRS 波群的終點(diǎn)與ST 段交接處）位移來(lái)評(píng)價(jià)是否有心肌缺血產(chǎn)生，同時(shí)以PR 段為基線對(duì)J點(diǎn)的位移進(jìn)行記錄，以J 點(diǎn)抬高或降低≥0.1 mV 視為發(fā)生心肌缺血[12]，同時(shí)記錄大鼠心率。

2.3.3 血TXB2、6-Keto-PGF1α測(cè)量 利用酶聯(lián)免疫法測(cè)定二者的含量，均按試劑盒指示檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 2 組大鼠肛溫情況比較 見(jiàn)表1。

表1 2 組大鼠肛溫情況比較（，n =20） ℃

表1 2 組大鼠肛溫情況比較（，n =20） ℃

注：與造模前比較，# P ＜0.05；與對(duì)照組比較，△P ＜0.05

3.2 2 組大鼠心電圖情況比較 見(jiàn)表2。

表2 2 組大鼠心電圖情況比較（，n =20）

表2 2 組大鼠心電圖情況比較（，n =20）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05

3.3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α情況比較 見(jiàn)表3。

表3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情況比較（，n =20） pg/mL

表3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情況比較（，n =20） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

4 討論

冠心病癥狀為氣短、胸悶、胸痛、心慌，其發(fā)病大多由寒邪侵襲、飲食失節(jié)、情志失調(diào)和勞累過(guò)度引起[13]。冠心病是現(xiàn)代社會(huì)多發(fā)疾病，其致殘率和致死率逐年升高，已造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[14]。近年來(lái)，在治療冠心病方面，中醫(yī)藥充分發(fā)揮特長(zhǎng)，以辨證論治為根本，從多路徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)治療，獲得了較好的臨床療效。因此，對(duì)其進(jìn)行更深層次的探索尤為必要，不僅從臨床方面，還要進(jìn)行基礎(chǔ)研究，從而獲得最優(yōu)方案，提高療效，縮短病程，減少社會(huì)經(jīng)濟(jì)支出。動(dòng)物模型的建立是冠心病基礎(chǔ)研究中的重要環(huán)節(jié)，如何規(guī)范化的建立既具備西醫(yī)疾病特點(diǎn)，又合乎中醫(yī)證候特征的模型，對(duì)于中醫(yī)藥的基礎(chǔ)研發(fā)具有重要意義。

中醫(yī)動(dòng)物模型的證型建立需要借鑒現(xiàn)代科技方法，并與之結(jié)合，不能局限于單一的生理變化，要整體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估，從多角度，多方面進(jìn)行觀察，才有利于中醫(yī)病證動(dòng)物模型的成功建立。從整體、系統(tǒng)出發(fā)，有利于更加深入地理解中醫(yī)的傳統(tǒng)理論，從而逐漸深入探索出“證”的本質(zhì)[15-16]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的創(chuàng)建，原則上應(yīng)選取與人類(lèi)構(gòu)造最為接近的動(dòng)物[17]，如小豬是最佳選擇，因?yàn)樾∝i的心血管結(jié)構(gòu)和人類(lèi)的最為相近，但由于實(shí)驗(yàn)小豬價(jià)格相對(duì)較高，不易于實(shí)際應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)，而大鼠雖不如小豬和人類(lèi)心血管結(jié)構(gòu)相近，但容易飼養(yǎng)，方便管理，檢驗(yàn)測(cè)量相關(guān)指標(biāo)也相對(duì)容易，故將大鼠作為本實(shí)驗(yàn)的模型動(dòng)物。

在該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立過(guò)程中，參考了胸痹心痛病寒凝血瘀證的診斷標(biāo)準(zhǔn)：胸痛如絞，時(shí)作時(shí)止，感寒痛甚，胸悶，氣短，心悸，面色蒼白，四肢不溫，舌質(zhì)淡紅，苔白，脈沉細(xì)或沉緊。但由于大鼠與人類(lèi)有著差異，所以對(duì)于大鼠的證候確認(rèn)通過(guò)以下方式：查超聲心動(dòng)圖來(lái)反應(yīng)大鼠的是否有胸悶痛；觀測(cè)大鼠的呼吸來(lái)體現(xiàn)是否心悸氣短；用空調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)溫度來(lái)觀察大鼠的胸悶痛是否與寒冷相關(guān)；因大鼠和人的差異，面色沒(méi)法收集，所以通過(guò)觀測(cè)大鼠足底圖像來(lái)代表面色；利用溫度計(jì)以測(cè)定四肢溫度；用舌面的顏色飽和程度來(lái)體現(xiàn)舌象變化；測(cè)量血管搏動(dòng)強(qiáng)度來(lái)體現(xiàn)脈象情況。最后再結(jié)合大鼠的病理指標(biāo)，建成完整的寒凝血瘀證型模型。冠脈造影[18]（CAG）是診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于冠脈造影價(jià)格較高，所以也不作為動(dòng)物模型建立的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

J 點(diǎn)，位于QRS 波后，T 波之前，二者交界的地方，即ST段起始部，ST段的位移可反映心肌缺血的情況。寒性凝滯，使血脈收縮，氣血運(yùn)行不暢，日久導(dǎo)致瘀血，因此出現(xiàn)J 點(diǎn)的位移，即ST 段的變化；寒性凜冽，易傷陽(yáng)氣，心為人體之太陽(yáng)，故首當(dāng)其沖，心陽(yáng)不足，失于溫煦，因此鼓動(dòng)乏力，不僅心率減慢，更使氣血運(yùn)行遲滯。

垂體后葉素[19]是一種從動(dòng)物的腦垂體中提取的物質(zhì)，大量的垂體后葉素靜脈注射可引起冠狀動(dòng)脈較長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)烈痙攣，同時(shí)還收縮全身小血管，加重外周負(fù)荷，增加心肌的耗氧量，導(dǎo)致急性心肌缺血，引起急性心絞痛發(fā)生。TXA2與PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物是TXB2、6-Keto-PGF1α，故檢測(cè)TXA2和PGI2在體內(nèi)的含量與活性，只需測(cè)量TXB2和6-Keto-PGF1α含量水平即可[20]。TXA2與PGI2均由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放，是一種血管活性物質(zhì)，TXA2能促進(jìn)血管收縮和血小板聚集，PGI2則與之作用相反，在舒張血管的同時(shí)抑制血小板的聚集[21]，TXA2/PGI2的失衡被認(rèn)為是血瘀證的特征之一[22]。

中醫(yī)認(rèn)為，寒性收引，易傷陽(yáng)氣，使血脈運(yùn)行不暢通，進(jìn)而出現(xiàn)瘀滯?！端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論篇》曰：“寒氣積于胸中而不瀉，不瀉則溫氣去，寒獨(dú)留，則血凝泣，凝則脈不通?！奔搓U明寒邪侵犯于人體胸部而不消散，寒邪留存，使血脈凝澀。本研究通過(guò)股靜脈注射較大劑量的垂體后葉素，使其冠脈收縮，再結(jié)合反復(fù)冷刺激法，構(gòu)建出寒凝血瘀證動(dòng)物模型，通過(guò)測(cè)量肛溫降低、心率減慢等指標(biāo)，反映出寒冷因素對(duì)大鼠體溫的影響；心電圖J點(diǎn)變化，符合急性心肌缺血心電圖的特點(diǎn)[23]，TXB2水平的顯著上升以及6-Keto-PGF1α的下降與血瘀證特點(diǎn)吻合。

綜上所述，應(yīng)用本方式可成功建立大鼠寒凝血瘀證模型，既具備西醫(yī)疾病的病理特點(diǎn)，又合乎中醫(yī)的證候特性，且客觀性強(qiáng)。