陳 鳳，閆晉強，李梅蘭，江 彪

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 晉中 030801；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】冬 瓜（Benincɑsɑ hispidɑCogn.）是我國重要的蔬菜作物，對調(diào)節(jié)蔬菜淡季、保證周年供應(yīng)有著重要作用［1］。酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)互作的重要分子生物學(xué)技術(shù)，也是研究生物大分子互作和調(diào)控的重要方法。構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫是運用酵母雙雜交技術(shù)的前提，其中均一化cDNA文庫可增加克隆低豐度mRNA的機會，克服基因轉(zhuǎn)錄水平的巨大差距給文庫篩選和分析帶來的障礙［2］。此外，構(gòu)建冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫為探究冬瓜基因功能奠定重要的材料基礎(chǔ)。【前人研究進展】構(gòu)建均一化cDNA文庫對新基因發(fā)掘并研究其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)具有重要作用，而運用SMART技術(shù)結(jié)合DSN均一化處理是構(gòu)建均一化酵母文庫的常用方法。李真真等［3］利用該技術(shù)構(gòu)建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文庫。茄子SmEDS1正調(diào)控青枯病抗性［4］，肖熙鷗等［5］利用酵母雙雜交技術(shù)從相應(yīng)的均一化cDNA酵母文庫中篩選到包括TCP轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的9個茄子SmEDS1互作蛋白，推測SmEDS1可能通過與TCP轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控水楊酸的合成，進而調(diào)控茄子的青枯病抗性。酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)分子間相互作用的有效手段［6］。構(gòu)建高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫是深入研究基因功能、高效率高質(zhì)量進行酵母雜交實驗的基礎(chǔ)［7］。在白菜［3］、甜瓜［8］、草莓［9］、黃瓜［10］、番茄［11］等蔬菜作物中已構(gòu)建了cDNA文庫。張文慧［10］通過構(gòu)建黃瓜頂芽cDNA文庫，以CsWIP1構(gòu)建雙雜交誘餌質(zhì)粒，以CsPI的啟動子片段構(gòu)建單雜交誘餌質(zhì)粒，篩選與其有相互作用的成分，獲得有效基因和單克隆測序。王洋等［11］以番茄的根、葉、花及不同發(fā)育時期的果實為材料，構(gòu)建酵母雙雜交文庫，并用于互作蛋白篩選?！颈狙芯壳腥朦c】冬瓜應(yīng)用基礎(chǔ)研究起步相對較晚，但基因組測序及核心種質(zhì)資源基因組重測序的完成顯著促進了冬瓜分子生物學(xué)的快速發(fā)展［12］，目前已對冬瓜果重、果實長度、果皮顏色等重要性狀進行了基因定位［1］。然而，冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建仍未見報道，一定程度上限制了依賴于酵母雙雜交技術(shù)的冬瓜基因功能研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以冬瓜參考基因組測序所用材料B227的根、莖、葉、雄花和嫩果等不同組織為試驗材料，構(gòu)建高質(zhì)量的冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫，以期為冬瓜蛋白質(zhì)互作等試驗提供物質(zhì)條件，為深入開展基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為冬瓜自交系B227（冬瓜參考基因組測序材料），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，于2019年春季種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地。在坐果期選取長勢良好植株的根、莖、葉、雄花、嫩果（開花后5 d）等組織，放置液氮中速凍后，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。實驗過程中主要采用cDNACloneMinerTMⅡ cDNA Library Construction Kit（Invitrogen）文庫構(gòu)建試劑盒進行文庫構(gòu)建。PureLink?HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit、LRClonaseTMⅡ Enzyme Mix、ElectroMAXTMDH10BTMT1 Phage Resistant Cells購 自Life。cDNACloneMinerTMⅡ cDNA Library Construction Kit試劑盒、Platinum?Taq DNA Polymerase試劑盒、Gateway?BP Clonase?ⅡEnzyme Mix試劑盒、PureLink?HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit試劑盒均購自Invitrogen公司。DSN酶試劑盒購自Evrogen公司。

1.2 RNA提取和mRNA分離

取適量不同組織樣品，利用CTAB法分別提取各組織總RNA并等量混合，隨后按照Invitrogen公司構(gòu)建cDNA文庫操作說明書進行mRNA的分離和純化，用1%瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA和mRNA的完整性，用NanoDrop 2000蛋白核酸定量測定儀測定其濃度和質(zhì)量。

1.3 雙鏈cDNA合成

以分離得到的mRNA為模板，利用SuperScriptⅢ RT酶按照試劑盒SuperScriptTMPlasmid System with Gate-way Technology for cDNA Synthesis and Cloning說明書進行cDNA第一條鏈的合成；以反轉(zhuǎn)錄后的第一鏈cDNA為模板，與在Escherichiɑ coliDNA Ligase、E.coliDNA Polymerase I和E.coliRNase H及T4 DNA Polymerase 的作用下反應(yīng)合成cDNA第二鏈，隨后與三框att B1 Adapter重組接頭連接。

1.4 cDNA均一化處理

按照DSN酶試劑盒（Evrogen）說明，進行帶接頭雙鏈cDNA的DSN均一化處理。以處理過的cDNA為模板，按照Platinum?Taq DNA Polymerase（Invitrogen）說明書進行2輪PCR擴增，PCR反應(yīng)程序：95 ℃1 min，95 ℃15 s，66 ℃20 s，72 ℃3 min，20個循環(huán)。然后按照文庫構(gòu)建試劑盒說明進行cDNA分級分離。

1.5 cDNA初級文庫構(gòu)建

按 照Gateway?BP Clonase?Ⅱ Enzyme Mix說明，處理得到的cDNA和pDONR222載體的BP重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化ElectroMAX DH10B細(xì)胞后，加2 mL S.O.C.培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)化杯中，將菌液吸至15 mL離心管中，在37 ℃搖床中225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d計數(shù)。在平板中隨機挑取24個單克隆，以pDONR222F（5'-TCCCAGTCACGACGTTGTAAAA CGACG GCCAGTCTT-3'）和pDONR222R（5'-AG AGCTGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATA CGAC TC-3'）為正、反向引物進行菌落PCR，PCR反應(yīng)程序：94 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35個循環(huán)，72 ℃5 min。按照“文庫庫容量（CFU）=平板上的克隆數(shù)/50 μL× 1 000倍×1×103μL×文庫菌液總體積（mL）”的方法，計算初級文庫庫容量和初級文庫重組率：

1.6 cDNA表達(dá)文庫構(gòu)建

取初級文庫菌液接種至100 mL肉湯培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，30℃下250 r/min搖菌培養(yǎng)至OD600為1.0。使用PureLink?HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit提取文庫質(zhì)粒，并將pGADT7-DEST載體與初級文庫質(zhì)?；旌线M行LR重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B后，添加2 mL S.O.C.培養(yǎng)基到電轉(zhuǎn)化杯中，將菌液吸至15 mL離心管中，置于37℃、225～250 r/min培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取菌液1 μL按照1∶1 000稀釋，取50 μL涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜，第2天計數(shù)。剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度為20%并存于-80℃，此為酵母文庫菌液。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，以ADR（5'-GTGA ACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'）和T7（5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA GCGCCGCCATG-3'）為正、反向引物進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取及mRNA分離

采用CTAB法提取冬瓜不同組織RNA，等量混合后進行RNA質(zhì)量檢測。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示28S和18S條帶清晰，寬度和亮度約為2∶1，無拖尾現(xiàn)象，核糖體RNA條帶清晰且完整、穩(wěn)定性好（圖1A）?？俁NA經(jīng)分離和純化后獲得mRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質(zhì)量，結(jié)果（圖1B）顯示純化后的mRNA彌散性分布、長度分布均勻、條帶范圍分布廣，拖帶最亮部分大于500 bp。表明分離純化的mRNA質(zhì)量良好，可作為建庫起始樣品。

圖1 總RNA 提?。ˋ）及mRNA分離（B）Fig.1 Total RNA extraction（A）and mRNA isolation（B）

2.2 均一化cDNA初級文庫的構(gòu)建

由圖2可知，均一化處理后，與原來的cDNA相比，均一化的cDNA沒有較亮的特異條帶，片段呈均勻彌散分布，表明不同片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拷貝數(shù)已是相似數(shù)量，實現(xiàn)了不同轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)量的均一化。

以均一化的cDNA為模板構(gòu)建初級文庫，經(jīng)統(tǒng)計，平均每個平板菌落生長的克隆數(shù)為206個（圖3），計算出初級文庫庫容量為8.24×106CFU。隨機挑選文庫中24個單克隆進行菌落PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示均有擴增產(chǎn)物，初級文庫重組率為100%；擴增出的插入片段大小不一，插入片段平均長度大于850 bp，主要分布在850～3 000 bp，說明轉(zhuǎn)入了大小不等的片段（圖4）。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的均一化cDNA初級文庫重組率較高、質(zhì)量好，可用于后續(xù)次級文庫的構(gòu)建。

圖4 初級文庫重組率檢測Fig.4 Detection of recombination rate of primary library

2.3 次級文庫的構(gòu)建及質(zhì)量鑒定

將pGADT7-DEST載體與初級文庫質(zhì)粒稀釋后混合于LR重組反應(yīng)體系，重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B后，培養(yǎng)得到酵母文庫菌液。取菌液10 μL按照1∶1 000稀釋后，取50 μL涂布LB平板計數(shù)生長克隆用于庫容量鑒定。平均每個平板菌落生長的克隆數(shù)為258個（圖5），根據(jù)公式計算冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫的庫容量為1.03×107CFU，足以克隆到低豐度表達(dá)的基因。隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，用瓊脂糖凝膠電泳檢測插入cDNA片段的大小。由圖6可知，挑取的24個單菌落均有效擴增，表明得到的酵母文庫陽性重組率達(dá)100%；擴增出的插入片段大小集中在850～3 000 bp，條帶之間大小存在明顯差異，表明文庫多態(tài)性良好；擴增條帶基本上都大于1 000 bp，表明文庫中長片段所占比例較大，插入片段序列的完整性較好。綜上所述，本研究構(gòu)建的酵母文庫完整性好、覆蓋度高，能反映來自冬瓜組織的遺傳信息，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于后續(xù)互作蛋白篩選或蛋白與DNA互作等相關(guān)試驗。

圖5 酵母雙雜交 cDNA 文庫庫容量鑒定Fig.5 Identification of yeast two-hybrid cDNA library capacity

圖6 酵母雙雜交 cDNA 文庫重組率鑒定Fig.6 Identification of recombination rate of yeast two-hybrid cDNA library

3 討論

酵母雜交技術(shù)是進行基因功能研究的重要手段，構(gòu)建高質(zhì)量的酵母文庫是進行酵母雜交技術(shù)的基礎(chǔ)。為避免文庫中組織特異性表達(dá)基因的丟失，本研究以冬瓜參考基因組所用材料B227的根、莖、葉、雄花和嫩果等不同組織為材料，構(gòu)建均一化酵母雙雜交cDNA文庫。高純度、完整性好的mRNA是構(gòu)建文庫的關(guān)鍵，直接影響文庫質(zhì)量［13］。本研究提取的冬瓜組織混合RNA樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清楚，無明顯降解，純度和完整性較高；分離純化后的mRNA呈彌散狀均勻分布，質(zhì)量較高，符合建庫要求。cDNA文庫的質(zhì)量可根據(jù)其代表性和重組序列的完整性進行評價［14-16］，且一個具備完整信息的cDNA文庫的庫容量至少應(yīng)達(dá)到1×106CFU［17］。本研究構(gòu)建的初級和次級cDNA文庫的庫容量分別為8.24×106CFU和1.03×107CFU，容量均達(dá)到建庫標(biāo)準(zhǔn)，說明本文庫覆蓋度完整，滿足了低豐度mRNA的篩選要求。文庫中的重組cDNA插入片段大小和基因的重組率代表重組序列的完整性［18-19］。植物cDNA長度在0.5～3.0 kb之間，文庫插入片段過小或過大均會對文庫質(zhì)量造成一定影響［20］。本研究構(gòu)建的初級和次級cDNA文庫基因重組率均是100%，且插入片段主要集中在850～3 000 bp，說明本文庫重組的cDNA序列遺傳信息完整性高，符合cDNA文庫的完整性好、高質(zhì)量等要求。

cDNA文庫的普遍應(yīng)用已取得一定成果，不僅可以用于目的基因克隆，而且還適用于基因功能研究?；ㄉ鶤hRRS5基因是花生響應(yīng)青枯病菌侵染的正調(diào)控因子［21］，陳玉婷等［22］利用酵母雙雜交技術(shù)從青枯病菌誘導(dǎo)的花生根組織cDNA文庫中篩選到包括AhSBT1.6在內(nèi)的互作蛋白，并通過雙分子熒光互補驗證了AhRRS5與AhSBT1.6體內(nèi)互作關(guān)系，為研究AhRRS5基因提供花生青枯病菌抗性的分子機制奠定了重要基礎(chǔ)。通過酵母雙雜交技術(shù)，廖鈺秋等［23］從馬鈴薯cDNA文庫中篩選到若干StMAPKK1互作蛋白，為研究該基因參與植物生長發(fā)育等功能提供依據(jù)。

在冬瓜及其變種節(jié)瓜中，研究者進行了部分基因的克隆和表達(dá)分析。冬瓜BhMAPK15在高溫、低溫和干旱等非生物脅迫下表達(dá)量發(fā)生變化，表明該基因參與冬瓜非生物脅迫響應(yīng)［24］。節(jié)瓜CqACS基因受GA3誘導(dǎo)表達(dá)，且在普通材料中雄花和雌花中的表達(dá)量顯著高于雌性系材料，表明CqACS可能與節(jié)瓜性型分化有關(guān)［25］。此外，本課題組及其他冬瓜研究團隊已經(jīng)開展重要農(nóng)藝性狀的基因定位，之后將會進行候選基因的挖掘和功能驗證。冬瓜cDNA文庫的缺乏在一定程度上限制了冬瓜基因功能的研究工作，因此，本研究所構(gòu)建的冬瓜酵母雙雜交cDNA文庫具有重要意義，為后續(xù)開展相關(guān)基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以冬瓜參考基因組測序材料B227的根、莖、葉、雄花、嫩果等不同組織為材料，經(jīng)過RNA提取、mRNA分離、cDNA合成并進行DSN均一化處理后，以此為模板連接到pGADT7-DEST載體，成功構(gòu)建了冬瓜均一化酵母雙雜交cDNA文庫。該cDNA文庫庫容量為1.03×107CFU，重組率為100%，插入片段主要集中在850～3 000 bp。文庫中長片段所占比例較大，插入片段序列的完整性較好，均一化處理提升了研究表達(dá)豐度較低蛋白的成功率。綜上所述，本研究所構(gòu)建的酵母文庫完整性好、覆蓋度高，能反映來自冬瓜組織的遺傳信息，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于后續(xù)依賴于酵母雙雜交技術(shù)的互作蛋白篩選或蛋白與DNA互作等相關(guān)試驗，為冬瓜基因功能研究、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析的開展提供了條件。