王顯赫，徐梧皓，張鑫林，馬大宇，雷亞峰，鄭亮，2，郭德軒，吳志軍，2，3，張華，2，3，曹宏偉，2，3

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163000；2.黑龍江八一農墾大學動物科技學院；3.黑龍江八一農墾大學生物技術中心）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）的一種單股正鏈RNA 病毒，屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）α 冠狀病毒屬（Coronavirus）的成員之一[1]。該病對各年齡段的豬皆易感，并且能夠引起仔豬的嘔吐，腹瀉，脫水而死，感染仔豬死亡率高達百分之九十[2]。雖然目前全球的科研工作者已經(jīng)對PEDV 病毒有了較為廣泛的認知與研究，但由于其RNA 病毒具有高變異性等特點，導致一直以來并沒有特別有效的方法控制其增殖，任由其肆虐全球。

E 基因是PEDV 編碼最小的一個結構蛋白基因，全長為231 bp，其編碼蛋白大小約為7 kD，由76 個氨基酸組成，為II 型膜蛋白[3]。E 蛋白也是病毒粒子囊膜的組成成分之一，其C 端朝向病毒粒子的內部，N 端朝向病毒粒子的外部，并且包埋在脂質雙分子層中[4]。與其他結構蛋白類似，E 蛋白也是一個多功能的蛋白，參與病毒囊膜的形成，在病毒復制和出芽過程中起重要作用[5]。

內質網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞的重要細胞器，主要負責蛋白質折疊和修飾、脂質生物合成和鈣穩(wěn)態(tài)[6-9]。當病原體入侵時，未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網(wǎng)中積累，常常會導致內質網(wǎng)應激，內質網(wǎng)應激與宿主抗病毒天然免疫有著密切關系，內質網(wǎng)應激往往能夠激活天然免疫信號通路來抑制病毒的復制[9-11]。在內質網(wǎng)應激下，能夠激活一種叫做未折疊蛋白反應（Unfold protein response，UPR）的信號通路。UPR 通過減弱蛋白質合成、上調蛋白質折疊和轉運機制以及激活ER 相關降解系統(tǒng)來恢復ER 穩(wěn)態(tài)。當內質網(wǎng)應激時間過長且嚴重到內質網(wǎng)功能無法恢復時，UPR 會通過激活細胞凋亡來清除受損細胞[12-16]。研究以PEDV E 蛋白的真核表達載體感染宿主細胞，驗證其正確表達和亞細胞定位，并通過利用免疫印跡技術檢測UPR 反應的關鍵蛋白GRP78 表達水平，研究PEDV E 蛋白對內質網(wǎng)應激與未折疊蛋白反應的影響，為PEDV 與內質網(wǎng)應激之間的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與質粒

人腎上皮細胞（HEK-293T）、豬腎上皮細胞（PK15）由實驗室保存。細胞用Gibco 生物公司DMEM 培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清以及100 μg·mL-1的青霉素與鏈霉素，在含5% CO2的37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pCMV-Myc 質粒和pCMV-Myc-E 質粒（PEDV E基因連接至pCMV-Myc 載體）由實驗室構建保存。

1.1.2 抗體與試劑

鼠抗β-actin（TA-09）、山羊抗小鼠辣根酶標記IgG（ZB-2305）、山羊抗兔辣根酶標記IgG（ZB-2301）、鼠抗Myc 單克隆抗體（TA-01）、兔抗β-actin單克隆抗體（ZM-0001）、TRITC 標記的山羊抗小鼠IgG（ZF-0313）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗GRP78 抗體（AF-0171）購自碧云天生物技術公司；轉染試劑脂質體Lipo 2000（11668019）購自Invitrogen 公司；質粒小提試劑盒（D6943-02）和膠回收試劑盒（D2500-02）購自Omega 公司；毒胡蘿卜素Thapsigargin（T9033）購自Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PEDV E 蛋白轉染細胞

在轉染質粒的前一天將HEK-293T 和PK15 細胞接種到24 孔板中，待細胞長滿每孔的80%時，用PBS 緩沖液清洗細胞培養(yǎng)板，每孔加入400 μL 不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，放入含5%CO2的37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 。將對應的pCMV-Myc質粒和pCMV-Myc-E 質粒以800 ng 劑量與轉染試劑脂質體Lipo 2000 混合，靜置20 min 后，加入到相應的孔中分別培養(yǎng)12、24 h 和48 h 后收集細胞。

1.2.2 PEDV E 蛋白間接免疫熒光（IFA）鑒定

取出已經(jīng)培養(yǎng)HEK-293T 和PK15 細胞24 h 后的細胞培養(yǎng)板，棄掉細胞培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗兩次細胞培養(yǎng)孔，每孔500 μL 4%多聚甲醛固定細胞20 min，利用預冷PBS 清洗細胞孔3 次，每孔加入250 μL 濃度為0.1%的Triton X-100 溶液，透膜20 min，再次利用PBS 緩沖液清洗細胞孔3 次，每孔加入500 μL 現(xiàn)用現(xiàn)配的5%BSA 封閉2 h，再次利用PBS 緩沖液清洗細胞孔3 次，每孔加入250 μL 鼠抗Myc 單克隆抗體（1∶500）作為一抗室溫孵育2 h，利用PBS 緩沖液清洗細胞孔3 次，每孔加入250 μL 的TRITC 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶500）作為二抗室溫避光孵育2 h，利用PBS 緩沖液清洗細胞孔3 次，DAPI 染色劑染色10 min 后用免疫熒光顯微鏡觀察PEDV E 蛋白表達。

1.2.3 Western Blot 檢測PEDV E 蛋白對內質網(wǎng)應激關鍵蛋白GRP78 的影響

將已經(jīng)分別轉染12、24 h 和48 h 后的細胞培養(yǎng)板取出，每孔用PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入35 μL 含1∶100 PMSF 的RIPA 裂解液在冰上裂解細胞30 min，用細胞刮刀將細胞刮下并且收集到1.5 ml EP 管中，4 ℃，12 000×g 離心10 min。取新的1.5 mL EP 管加入8.75 μL 的5×Loading Buffer，與上清混勻后沸水浴變性10 min，再次12 000×g 離心10 min。配置SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣10 μL，濃縮膠和分離膠分別用80 V 和120 V 電壓進行電泳，對應Marker 剪下條帶（GRP78：72 KDa；β-actin：42 KDa；Myc-E：15 KDa）。恒定電流0.2 A 轉膜150 min，用5%脫脂奶粉封閉2 h。分別以兔抗GRP78 抗體（1∶1 000），鼠抗β-actin（1∶1 000）和鼠抗Myc（1∶1 000）為一抗孵育2 h，用TBST 緩沖液清洗8 次，每次15 min；山羊抗兔辣根酶標記IgG（1∶3 000）和山羊抗小鼠辣根酶標記IgG 為二抗孵育2 h，用TBST 緩沖液清洗8 次，每次15 min，最后曝光得出結果。進行Western Blot 檢測PEDV E 蛋白時間和劑量梯度對UPR 反應關鍵蛋白GRP78 表達的影響。

2 結果與分析

2.1 PEDV E 蛋白Western Blot 檢測表達情況

將pCMV-Myc-E 質粒和空白組分別轉染HEK-293T 和PK15 細胞系24 h 后收樣，通過Western Blot檢測PEDV E 蛋白表達情況，結果顯示，轉染pCMVMyc-E 質粒的實驗組檢測到了PEDV E 蛋白的條帶，而轉染pCMV-Myc 質粒以及空白對照實驗組沒有檢測到PEDV E 蛋白的表達（圖1），以上結果說明pCMV-Myc-E 質粒能夠在HEK-293T、PK15 細胞系內表達E 蛋白。

圖1 Western Blot 檢測證實PEDV E 蛋白表達Fig.1 Western Blot test confirmed PEDV E protein expression

2.2 PEDV E 蛋白間接免疫熒光（IFA）檢測表達情況

利用pCMV-Myc-E 質粒分別轉染HEK-293T、PK15 細胞系24 h 后收樣，運用IFA 方法檢測PEDVE 蛋白，結果顯示，在HEK-293T 細胞系內，轉染pCMV-Myc-E 質粒的實驗組檢測到了定位在細胞質上的PEDV E 蛋白，而轉染pCMV-Myc 質粒以及空白對照實驗組并沒有檢測到PEDV E 蛋白的表達，在PK15 細胞系內有同樣的結果（圖2），以上結果同樣說明pCMV-Myc-E 質粒能夠在HEK-293T、PK15 細胞系內表達E 蛋白。

圖2 間接免疫熒光（IFA）檢測PEDV E 蛋白表達Fig.2 Indirect immunofluorescence detection of PEDV E protein expression

2.3 PEDV E 蛋白能夠內質網(wǎng)應激關鍵蛋白GRP78的上調

將pCMV-Myc-E 質粒分別轉染HEK-293T、PK15 細胞系24 h 后收樣，運用Western Blot 檢測內質網(wǎng)應激關鍵蛋白GRP78 的變化，結果顯示，轉染pCMV-Myc-E 重組質粒實驗組和毒胡蘿卜素Thapsigargin（TG）處理組的GRP78 蛋白表達量與空白對照組相比有非常明顯的增加，而轉染pCMV-Myc 質粒實驗組的GRP78 蛋白表達量與空白對照組相比則無明顯差異（圖3）。以上結果表明，PEDV E 蛋白轉染HEK-293T、PK15 細胞能夠引起GRP78 蛋白表達量的上調，進而引起UPR 反應和內質網(wǎng)應激。而pCMV-Myc 質粒轉染HEK-293T、PK15 細胞并不能夠引起GRP78 蛋白表達量的上調。

圖3 PEDV E 蛋白能夠引起UPR 關鍵蛋白GRP78 的上調Fig.3 PEDV E protein can cause the up-regulation of UPR key protein GRP78

2.4 PEDV E 蛋白劑量梯度引起UPR 關鍵蛋白GRP78 表達情況

利用pCMV-Myc-E 質粒以及pCMV-Myc 質粒以劑量梯度（800、1 200、1 600 ng）分別轉染HEK-293T、PK15 細胞24 h 后收樣。Western Blot 檢測結果顯示，UPR 關鍵蛋白GRP78 蛋白表達量隨著轉染pCMVMyc-E 質粒濃度的升高而表達量逐漸上調，而PEDV E 蛋白的表達量也逐漸增加；而GRP78 蛋白的表達量并不隨著pCMV-Myc 質粒轉染濃度的提升而增加（圖4），以上結果表明，隨著PEDV E 蛋白轉染劑量的增多，GRP78 蛋白的表達量也隨之增加，UPR 反應逐漸加劇，而隨著pCMV-Myc 質粒轉染劑量的增加，GRP78 蛋白的表達量無明顯變化，這進一步說明pCMV-Myc 不能夠引起內質網(wǎng)應激。

圖4 PEDV E 蛋白劑量梯度引起UPR 關鍵蛋白GRP78 表達上調Fig.4 PEDV E protein dose gradient causes up-regulation of UPR key protein GRP78 expression

2.5 PEDV E 蛋白時間梯度轉染引起UPR 關鍵蛋白GRP78 表達情況

利用pCMV-Myc-E 質粒以及pCMV-Myc 質粒以時間梯度（12、24、48 h），800 ng 分別轉染HEK-293T、PK15 細胞收樣。Western Blot 檢測結果顯示，內質網(wǎng)應激關鍵蛋白GRP78 蛋白表達量隨著轉染pCMVMyc-E 質粒轉染時間的延長而表達量逐漸上調，而PEDV E 蛋白的表達量也逐漸增加；而GRP78 蛋白的表達量并不隨著pCMV-Myc 質粒轉染時間的延長而增加（圖5），以上結果表明，隨著PEDV E 蛋白轉染時間的增加，GRP78 蛋白的表達量也隨之增加，內質網(wǎng)應激反應逐漸加劇，而隨著pCMV-Myc 質粒轉染時間的增加，GRP78 蛋白的表達量無明顯變化，這說明pCMV-Myc 不能夠引起內質網(wǎng)應激。

圖5 PEDV E 蛋白時間梯度引起內質網(wǎng)應激關鍵蛋白GRP78 表達上調Fig.5 The time gradient of PEDV E protein causes up-regulation of the expression of GRP78，a key protein of endoplasmic reticulum stress

3 討論

內質網(wǎng)是真核細胞內合成與運輸?shù)鞍踪|重要的細胞器，當外界環(huán)境發(fā)生變化，如：紫外滅活，與葡萄糖剝奪、缺氧、異常Ca2+的調節(jié)，以及病原體的入侵等等，內質網(wǎng)腔內會累積大量的未折疊或錯誤折疊蛋白質。這些未折疊蛋白質能夠引起結合在未折疊蛋白反應（UPR）效應器上的葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）解離并且與未折疊蛋白質結合，激活UPR反應，進而激活內質網(wǎng)應激。目前已有研究發(fā)現(xiàn)多種病毒感染能夠激活UPR 反應，如：TGEV 病毒感染細胞會激活全部的三種UPR 信號通路，并且PERKeIF2α 信號通路可以負調控TGEV 病毒的復制[17]；陳全鋼的研究發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染MARC-145 細胞能夠激活PERK 和IRE-1 信號通路，但不激活ATF6 信號通路[18]；腸道病毒EV71 感染細胞能夠激活IRE1-XBP1 和PERK 信號通路，而且抑制磷酸化的IRE1 時，病毒的復制能力增強，抑制IRE1 核酸內切酶活性會導致EV71 病毒復制能力的減弱[19]。

PEDV 自2010 年在我國大規(guī)模爆發(fā)以來，由于其對仔豬高致死率以及高突變性，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。而E 蛋白又是構成PEDV 的結構蛋白之一，能夠參與病毒囊膜的形成并且在病毒復制與出芽過程中發(fā)揮重要作用[20]。因此，研究PEDV E 蛋白對內質網(wǎng)的刺激以及內質網(wǎng)應激下游分子調控PEDV 的復制就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV E 蛋白能夠引起內質網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78 的增加，說明PEDV E 蛋白能夠引起內質網(wǎng)應激反應，由于PEDV E 蛋白定位在細胞質上，當PEDV E 蛋白表達量隨著轉染劑量和轉染時間的增加而增加，導致內質網(wǎng)中未折疊或者錯誤折疊蛋白數(shù)量上升，GRP78 蛋白與UPR 反應效應器分離，激活了UPR 反應，但是具體是激活UPR 反應的哪幾條信號通路，對內質網(wǎng)應激下游分子的調控還需后續(xù)研究證明，以其為研制出PEDV 與宿主互作提供理論基礎。