盧大儒

2019年底起至今在全球肆虐的新冠肺炎突如其來，來勢洶洶，究竟是怎么回事？人們是怎么迅速找到不明原因肺炎的病原體的？這種病毒為什么具有很強的感染性和致病性？為什么又狡猾多變？如何能夠快速診斷出患者，甚至發(fā)現(xiàn)無癥狀的攜帶者？又是如何研發(fā)出針對性的疫苗，預防病毒的感染的？ 這一切均離不開基因與基因技術。

基因技術及其四個最重要、最基本的代表

基因是建造大樓的“圖紙”，也是長成參天大樹的“種子”，是生命的密碼、生命的本質(zhì)、生命的語言，也是最基本的因素。而生命是基因的活動和表現(xiàn)形式，是基因的舞臺。歷史上，多少基因在“生命舞臺”上表演過，又有多少基因在經(jīng)歷風雨的洗禮后逐漸“逝去”，沒有永遠的主角。生命永遠絢麗多姿，而基因是生命的中心，一切都是為了DNA的復制、傳承。

基因技術有四個最重要、最基本的代表，也是基因技術的“四駕馬車”：一是重組DNA技術，這個技術就是把不同來源的DNA、分子進行重新組合，是當時最早實現(xiàn)基因重組的一種技術方法；二是DNA聚合酶鏈式反應（PCR）技術，有了PCR技術，研究人員可以在1～2小時內(nèi)，在試管里將基因放大數(shù)百萬倍；三是DNA測序技術，它是閱讀生命基因、解碼生命最重要的一種技術；四是基因編輯技術，它可以準確地修改基因，對于基因的功能研究、物種改良、基因治療都非常重要，也是近幾年生命科學研究的熱點。

2020年是特殊的一年，新冠肺炎疫情在全球肆虐。其實在疫情發(fā)現(xiàn)之初，科研工作者借助基因技術就逐步揭開了新冠病毒背后的秘密，如追尋新冠肺炎病原體、助力新冠肺炎診斷及新冠肺炎疫苗和藥物開發(fā)、探究新冠病毒感染與致病機制等。

追尋不明原因肺炎致病元兇立頭功

新冠病毒呈球狀，直徑約為100～140納米?；蚪M為約有3萬個核酸的單股正鏈RNA，為最大的RNA病毒之一。

2019年12月24日，武漢市某醫(yī)院將一名來自華南海鮮市場不明原因肺炎患者的肺泡灌洗液樣本進行二代測序（NGS）。NGS是一種高通量測序方法，可以對生物樣本的DNA或RNA樣本的堿基對進行快速測序。3天后，檢測和分析人員就通過NGS和生物信息比對迅速發(fā)現(xiàn)該未知病原體與急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的相似度約81%，結果顯示這是一種新的冠狀病毒。這種病毒從核酸序列上比對分析，與當年的SARS-CoV非常相似。應該說，NGS測序技術在這次新冠肺炎病原體鎖定中立了頭功。 此前，若想破解不明原因的病原體要花費大量的時間，更多的人力物力，而現(xiàn)在通過NGS對病原體測序并與信息數(shù)據(jù)庫比對，只需要3天，甚至更短的時間即可確定此次病原體為一種新的冠狀病毒。

基因測序技術在發(fā)現(xiàn)不明病原體的過程中發(fā)揮著重要作用。NGS測序發(fā)展迅速，應用廣泛，成本急劇下降，得到的數(shù)據(jù)量也越來越大，這也意味我們已經(jīng)進入了基因組時代?；驕y序技術在今天迅速普及，能夠讓研究人員迅速地認識、挖掘、鎖定不明原因傳染病中的病原體。值得一提的是，現(xiàn)在采用微小的只有U盤大小的第三代納米孔測序儀，可以在現(xiàn)場花數(shù)小時就能發(fā)現(xiàn)疾病樣本中不明原因的病原體。

這次的新冠病毒感染能力遠超當年的SARS，如果還是像當年那樣，要經(jīng)過半年才鑒別出病原體，那后果不堪設想。幸虧，NGS在當今能夠迅速發(fā)展和應用，真是天佑中華！

PCR技術

解決新冠肺炎快速精準診斷難題

病原性疾病的病原體檢測是預防和治療的關鍵，機體在病毒感染后會產(chǎn)生特異性抗體，免疫學檢測就是檢查其特異性抗體，這是病原性疾病診斷的重要方法。然而，由于病原體感染存在窗口期，往往是感染后1～2周內(nèi)，難以早期診斷。此外，對一些病原體，我們還有很多未知，更是無從下手。

任何病原體均有獨特的遺傳物質(zhì)，所以基于此進行的基因檢測（又稱核酸檢測）具有簡單、靈敏和特異的優(yōu)點，可用于感染性疾病快速而準確的檢測。由于基因檢測的靈敏特異性，病原體早期的感染也能夠檢測到，不存在窗口期。因此，核酸檢測成為病原體檢測的首選和金標準。

盡管核酸檢測會出現(xiàn)“假陰性”的問題，但依然是不可缺少的金標準。同時，臨床上要加強核酸檢測的各種質(zhì)量管理和控制，克服各種不確定因素，最終讓核酸檢測更加快速、靈敏、穩(wěn)定、安全、方便、簡單。

基因檢測技術有很多，如分子雜交法、PCR技術、等溫擴增技術、第一代DNA測序方法、原位雜交與熒光原位雜交（FISH）技術、基因芯片檢測法和高通量測序等，這些技術在不同疾病診斷當中發(fā)揮重要作用。

在臨床應用中，熒光定量PCR和等溫擴增檢測在這次新冠病毒篩查和診斷中發(fā)揮了重要作用，不僅能夠?qū)⒒颊邷蚀_檢測，而且可以將無癥狀感染者篩查出來， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局采用綠色通道批準了一批這方面的核酸檢測試劑盒上市，能夠在0.5～2小時內(nèi)完成檢測，不少試劑盒可以免提取核酸直接檢測。

助力疫苗開發(fā)，預防和阻斷病毒感染

病原性疾病的根源在于病原體，自然界宿主對入侵病原體也有各種招數(shù)應付，其核心招數(shù)是通過機體的免疫識別和應答。例如，限制性內(nèi)切酶、Cas核酸酶、RNA干擾（RNAi）等都是對外界病原體在核酸水平上進行特異的識別并清除。高等生物則發(fā)展了專門的在蛋白質(zhì)和細胞層面上的免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡，包括先天免疫和特異性免疫。與疫苗直接相關的就是通過體內(nèi)B淋巴細胞產(chǎn)生針對病原體的特異性抗體。

疫苗是將病原體及其代謝物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的免疫制劑。疫苗保留了病原菌刺激動物體免疫系統(tǒng)的特性。接種疫苗后，當機體再次接觸到這種病原時，免疫系統(tǒng)便會識別并阻止病原菌的傷害，其核心是通過誘導產(chǎn)生特異抗體。疫苗的發(fā)明是人類歷史上具有里程碑意義的事件?？刂苽魅拘约膊∽钪饕氖侄尉褪穷A防，而接種疫苗被認為是最行之有效的措施，所以預防新冠肺炎最重要的手段就是研發(fā)疫苗。

新冠疫情暴發(fā)后，中國立即布局了五條技術路線研發(fā)疫苗：一是滅活疫苗，制備新冠病毒并進行滅活，經(jīng)過安全性、有效性評價以后就可以用于臨床試驗，這是經(jīng)典的病毒疫苗制備方法；二是重組基因工程疫苗，通過基因工程大量生產(chǎn)新冠病毒刺突糖蛋白（S蛋白），并將其注射到人體產(chǎn)生抗體；三是腺病毒載體疫苗，用腺病毒作為載體，表達新冠病毒S蛋白，重組的腺病毒可以高效感染人體，刺激機體產(chǎn)生抗體；四是核酸疫苗，主要是mRNA疫苗，用脂質(zhì)體納米顆粒（LNP）等材料包裹核酸，注射到人體內(nèi)，可以表達出S蛋白，并刺激人體產(chǎn)生抗體，抵抗感染；五是流感病毒雙重疫苗，以國內(nèi)上市減毒流感病毒疫苗為載體，攜帶S基因，既可以預防新冠病毒，又可以預防流感。

由中國軍事科學院軍事醫(yī)學研究院陳薇院士帶領的研究團隊和康希諾生物股份公司聯(lián)合開發(fā)的重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體）于2020年3月份在國際上最先進入臨床試驗。美國莫德納公司（Moderna）成功研制出針新冠病毒的mRNA疫苗，也最早進入了臨床試驗。

從2020年底起陸續(xù)有疫苗獲批進入臨床使用；到目前為止，國際上已經(jīng)有十多種疫苗獲得緊急授權使用，包括美國莫德納公司的mRNA疫苗，美國輝瑞公司和德國BioNTech公司聯(lián)合研發(fā)的mRNA疫苗，強生公司的腺病毒疫苗，英國牛津大學與阿斯利康公司聯(lián)合研發(fā)的腺病毒疫苗，俄羅斯加馬列亞國家研究所研發(fā)的“衛(wèi)星-V”腺病毒疫苗等。

中國從2020年底至今在第一時間批準了國藥集團和科興公司的3款滅活新冠病毒疫苗，今年先后批準了康希諾公司等單位研發(fā)的腺病毒疫苗和安徽智飛龍科馬公司等研發(fā)的重組亞單位蛋白疫苗。復星醫(yī)藥與德國BioNTech公司合作的mRNA疫苗在香港和澳門獲準緊急使用。這樣，中國一共有6種疫苗獲批緊急授權使用。

除了滅活疫苗制備以外，其他各種疫苗研發(fā)均離不開基因技術，是在基因重組等技術基礎上開展研發(fā)的；如果要研發(fā)針對各種新冠病毒的變異體的疫苗，無論哪一種疫苗研究均離不開基因技術。根據(jù)病毒變異，借助基因工程技術，可以迅速地改變S蛋白基因序列，制備出針對變異病毒的各種疫苗。

基因技術推動新冠病毒藥物研發(fā)

新冠肺炎是一種新的疾病，致病機制尚需進一步研究，且缺乏有效藥物，基因技術又該如何助力特異藥物的開發(fā)？基因技術主要從以下幾個方面助推新冠病毒藥物研發(fā)：加速致病機制研究，揭示病毒的結構特征，明確藥物靶點；幫助建立病毒感染計算，蛋白、細胞模型以及藥物篩選模型；幫助建立新冠肺炎動物模型，開展藥物安全性有效性研究；通過制備病毒蛋白，篩選抗體，進行安全評估研究。

目前，研究人員發(fā)現(xiàn)新冠病毒有29種蛋白，針對這些蛋白，他們進行了結構功能性研究、藥物設計和篩選。其中，根據(jù)病毒生活周期，藥物篩選策略包含以下幾個方面：一是設置攔路虎，抑制病毒進入細胞，如通過靶向小肽、小分子和中和抗體對病毒表面的刺突糖蛋白進行封閉；二是斷糧草，抑制病毒蛋白酶活性，如PL、3CL蛋白酶抑制劑，阻止病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯；三是以假亂真，抑制病毒RNA依賴RNA聚合酶活性，如瑞德西韋（Remdesivir）就是一種抑制病毒RNA復制、轉(zhuǎn)錄的一種核苷酸類似物；四是尋求其他靶點，抑制病毒融合、包裝、轉(zhuǎn)運，如弗林蛋白酶（Furin）抑制劑、跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）抑制劑等。

不同新冠肺炎患者的癥狀與治療效果千差萬別，重癥患者、輕癥狀患者、無癥狀患者差異很大，產(chǎn)生差異的原因很多，如年齡問題、其他伴隨疾病、治療方案、病毒感染數(shù)量的多少以及病毒在患者體內(nèi)的變異程度、患者的遺傳基因多態(tài)性等，基因技術有助于我們揭示新冠病毒感染和治療的差異因素，更好地實現(xiàn)精準醫(yī)療。

新冠病毒的模型圖及解剖照片

探究新冠病毒感染與致病機制

新冠病毒是如何感染人的呢？依托于基因技術和其他分子細胞生物學方法的研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒借助其表面的刺突糖蛋白（S蛋白）與人體細胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結合，同時S蛋白會被跨膜絲氨酸蛋白酶（有輔助病毒感染的作用）裂解，進而激活。

針對ACE2，研究人員系統(tǒng)地開展了相關性研究，用于闡明病毒感染的動態(tài)機制，指導精準醫(yī)療。美國得克薩斯州大學的研究人員借助低溫冷凍電鏡技術解析了新冠病毒的刺突糖蛋白，新冠病毒通過與SARS病毒相同的受體ACE2進行感染和傳播。我國西湖大學的研究人員成功解析了新冠病毒感染受體ACE2的全長結構，對研究病毒感染機制、疫苗和藥物開發(fā)具有重要指導意義。

通過病毒序列的研究，南開大學的研究人員首次發(fā)現(xiàn)，此次的新冠病毒S蛋白中多了一個新的功能域位點——弗林蛋白酶切位點。正是由于這一包裝機制的改變，新冠病毒刺突糖蛋白獲得了更高的侵染細胞的效率，這可能也是其傳播能力強于SARS-CoV的一個原因。

通過對人體細胞ACE2基因表達分析，發(fā)現(xiàn)新冠病毒除了感染肺部以外，也可能感染其他組織器官。例如，感染患者有些伴有腹瀉等消化道癥狀，在糞便中檢測到新冠病毒。病毒可能從血液中轉(zhuǎn)移到腸道內(nèi)。神經(jīng)細胞也可能是感染區(qū)域，患者可以出現(xiàn)嗅覺和味覺失靈。通過進行單細胞RNA測序（RNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)，氣道、食道、肺、心臟、腎、回腸和膀胱都是ACE2高表達的組織和器官，所以要對這些器官加強保護。

新冠病毒的突然出現(xiàn)和肆虐，給人類社會敲響了警鐘：非常原始簡單的病毒可能對人類世界造成毀滅性的打擊，我們要全面加強病毒的防治研究，同時也要審視暴露的各種問題，重視基因技術在病原體預防診斷和治療研究中的生物安全防控。