呂光耀 蒲琳 陳乾 付啟忠 劉險(xiǎn)峰 董圣芳 楊建勛 劉穎

doi：10.3870/j.issn.1674-4624.2021.02.007

高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2, HMGA2)為目前的熱點(diǎn)癌基因之一[1]，HMGA2蛋白參與廣泛的生物學(xué)過(guò)程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化以及腫瘤發(fā)生等多個(gè)過(guò)程[2]。前期的研究結(jié)果表明，HMGA2在腎癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，且其蛋白表達(dá)水平與腎癌患者疾病進(jìn)展時(shí)間及預(yù)后密切相關(guān)[3]，腎癌細(xì)胞ACHN經(jīng)HMGA2基因沉默后，可明顯抑制該細(xì)胞的增殖及侵襲能力[4-5]。為了更好的說(shuō)明HMGA2在腎癌進(jìn)展中發(fā)揮的重要作用，我們通過(guò)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染建立HMGA2低表達(dá)細(xì)胞株，研究敲除HMGA2基因表達(dá)后，對(duì)ACHN細(xì)胞周期與凋亡的影響。

材料與方法

一、材料

ACHN細(xì)胞由凱基生物大連分公司提供。Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；鼠抗人HMGA2單克隆抗體及二抗山羊抗鼠IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與2×Taq PCR Master Mix(中國(guó)北京天根生化有限公司)；引物(中國(guó)北京奧科生物有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(凱基生物大連分公司)；HMGA2-siRNA及Mock-siRNA(上海吉瑪制藥公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen,批號(hào)V1324)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技)；熒光定量PCR循環(huán)儀(美國(guó)ABI Step one plus Real time-PCR system)；Trans-Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad 186-3217)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)腎癌細(xì)胞ACHN，細(xì)胞置于5% CO2飽和濕度37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，2～3 d傳代1次。

三、轉(zhuǎn)染

使用Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24 h后提取RNA行qRT-PCR檢測(cè)，48 h后提取蛋白行Western Blot檢測(cè)。

四、qRT-PCR法檢測(cè)ACHN細(xì)胞HMGA2 mRNA的表達(dá)情況

提取總RNA，采用分光光度儀測(cè)定RNA樣品的濃度，取5 μl RNA樣品到495 μl 1×TE Buffer中，然后取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作步驟按照相應(yīng)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)CW0581)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行產(chǎn)物的溶解曲線分析其產(chǎn)物特異性，記錄Ct值，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算標(biāo)本相對(duì)表達(dá)量，qPCR時(shí)以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本都要做對(duì)應(yīng)的內(nèi)參，而且每次都要做。其中，ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組HMGA2基因Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct)-(對(duì)照組HMGA2基因Ct-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct)。

五、Western Blot法檢測(cè)ACHN細(xì)胞HMGA2蛋白的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染48 h后，收集ACHN細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取其中的總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，應(yīng)用使用G:BOX chemiXR5成像，Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

六、PI染色檢測(cè)ACHN細(xì)胞周期情況

六孔板轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，無(wú)EDTA的胰酶消化細(xì)胞2 min后離心收集，PBS清洗3次后加入冷卻的70%乙醇溶液，吹散變成單細(xì)胞懸液，放于-20 ℃冰箱固定。1 500 rpm離心10 min后在上機(jī)前棄去固定液，用PBS洗3次徹底去除殘留乙醇，加600 μl PI染液迅速吹勻，4 ℃避光放置1 h，在488 nm波長(zhǎng)處用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光及光散射情況，分別測(cè)定未轉(zhuǎn)染組、HMGA2-siRNA組及Mock-siRNA組細(xì)胞 G0/G1期、S期和G2/M期的百分率。

七、Annexin V-FITC檢測(cè)ACHN細(xì)胞凋亡情況

六孔板轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞2 min后離心收集，用PBS洗2次，2 000 rpm在4 ℃的環(huán)境下離心5 min后吸去上清保留細(xì)胞沉淀。100 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞和5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl PI Staining Solution一起混勻，室溫避光反應(yīng)10 min后再加入400 μl的1×Binding Buffer。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，在FL1通道檢測(cè)FITC的綠色熒光，在FL3通道檢測(cè)PI的紅色熒光。早期凋亡細(xì)胞：AnnexinⅤ陽(yáng)性、7-AAD陰性；晚期凋亡細(xì)胞：AnnexinⅤ和7-AAD雙陽(yáng)性；細(xì)胞凋亡率為二者之和。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)以上各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行方差分析。

結(jié) 果

一、HMGA2低表達(dá)腎癌細(xì)胞株的建立

選擇HMGA2三個(gè)不同的基因片段分別為HMGA2-siRNA1、HMGA2-siRNA2、HMGA2-siRNA3和Mock-siRNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HMGA2-siRNA各組與Mock-siRNA組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比：HMGA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.08±0.00、0.04±0.00、0.12±0.02、1.05±0.05、1.00±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.968，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

1：Non-transfected；2：Mock-siRNA；3：HMGA2-siRNA1；4：HMGA2-siRNA2；5：HMGA2-siRNA3；圖1 siRNA干擾后HMGA2 mRNA表達(dá)情況(*F=56.968，與未轉(zhuǎn)染組比較P<0.01)

表達(dá)量分別為0.07±0.02、0.02±0.00、0.11±0.04、0.68±0.07、0.75±0.09，HMGA2蛋白在轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA組的表達(dá)明顯低于Mock-siRNA組和未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.815，P<0.01)，見(jiàn)圖2。以上結(jié)果顯示，siRNA干擾后，HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，說(shuō)明干擾效果良好，且siRNA特異性良好。其中HMGA2-siRNA2的mRNA和蛋白表達(dá)量均最低，我們選擇此基因片段做進(jìn)一步研究。

1：Non-transfected；2：Mock-siRNA；3：HMGA2-siRNA1；4：HMGA2-siRNA2；5：HMGA2-siRNA3；圖2 siRNA干擾后，HMGA2蛋白表達(dá)情況(F=27.815, 與未轉(zhuǎn)染組比較P<0.01)

二、siRNA干擾HMGA2表達(dá)后ACHN細(xì)胞周期的變化

如圖3、表1示，ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA可使G0/G1期細(xì)胞增加，而G2/M期細(xì)胞減少，HMGA2-siRNA使腎癌細(xì)胞ACHN阻滯在 G1期，所有數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(P<0.05)。

A：敲除Mock-siRNA后ACHN細(xì)胞周期分布情況；B：敲除HMGA2后ACHN細(xì)胞周期分布情況;C：未轉(zhuǎn)染組ACHN細(xì)胞周期分布情況圖3 PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(與未轉(zhuǎn)染組比較P<0.05)

表1 轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA后ACHN細(xì)胞周期分布的改變

三、siRNA干擾HMGA2表達(dá)后ACHN細(xì)胞凋亡的影響

如圖4、表2示，敲除HMGA2后，ACHN細(xì)胞的總體凋亡率從5.69%上升到16.52%(χ2=10.83，P<0.05)。

A：未轉(zhuǎn)染組ACHN細(xì)胞凋亡情況；B：敲除Mock-siRNA片段后ACHN細(xì)胞凋亡情況；C：敲除HMGA2后ACHN細(xì)胞凋亡情況圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況

表2 siRNA干擾后ACHN細(xì)胞凋亡情況

討 論

腎癌為泌尿系統(tǒng)較為常見(jiàn)的惡性腫瘤[6]。由于起病隱匿早期往往無(wú)特異性表現(xiàn)，目前仍以手術(shù)切除為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，約30%[7]。主要原因是由于腎癌分子生物學(xué)行為多變，傳統(tǒng)的TNM分期和Robson分級(jí)在評(píng)估腎癌的預(yù)后方面有很大的局限性[8]，而且腎細(xì)胞癌對(duì)化療及放療不敏感。因此，深入研究腎癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中分子作用的機(jī)制可為腎癌的臨床治療提供新的基因靶點(diǎn)及治療方式。

HMGA2是一個(gè)非組蛋白染色質(zhì)因子，它本身不具備轉(zhuǎn)錄因子活性，但可通過(guò)重組染色質(zhì)使其處于開(kāi)放狀態(tài)或者影響DNA-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)[9]。HMGA2可以對(duì)大量基因的轉(zhuǎn)錄和活化進(jìn)行調(diào)節(jié)，特別是那些與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的基因[10]。具體原因如下：①HMGA2誘導(dǎo)E2F1轉(zhuǎn)錄因子的活性導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，促進(jìn)向G2/M細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[11]；②HMGA2表達(dá)升高通過(guò)cAMP抑制P120E4F表達(dá)下調(diào)，使得細(xì)胞周期素A的表達(dá)增加，干擾細(xì)胞周期，促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展[12]；③HMGA2表達(dá)升高，破壞DNA修復(fù)系統(tǒng)[13]。前期研究結(jié)果表明，HMGA2在腎癌細(xì)胞系786-0、769-P、ACHN中表達(dá)均高于正常腎小管上皮細(xì)胞系HKC，且ACHN細(xì)胞系表達(dá)HMGA2 mRNA和蛋白較高，ACHN細(xì)胞被HMGA2-siRNA干擾后能達(dá)到基因沉默的目的，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[4-5]。因此推測(cè)HMGA2在腎癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到致癌基因的作用。腎癌細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞凋亡抑制是腎癌難以被徹底治愈的關(guān)鍵因素[14]。因此，本文在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探討HMGA2基因?qū)δI癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，采用RNA干擾技術(shù)，向ACHN細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA，轉(zhuǎn)染后HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，說(shuō)明達(dá)到了基因沉默的目的，且HMGA2-siRNA特異性良好，成功構(gòu)建了HMGA2低表達(dá)腎癌細(xì)胞株。隨后，我們?cè)谵D(zhuǎn)染后48 h經(jīng)PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染HMGA2-siRNA可使G0/G1期細(xì)胞增加，而G2/M期細(xì)胞減少，HMGA2-siRNA使腎癌細(xì)胞ACHN阻滯在G1期。

腫瘤發(fā)生的共同特征之一是細(xì)胞周期紊亂，許多不同的證據(jù)說(shuō)明，HMGA2通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[15]。HMGA2可通過(guò)上調(diào)Cyclin A2、Cyclin B2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期 G2/M期的轉(zhuǎn)化[16]。有研究報(bào)道HMGA2能與轉(zhuǎn)錄抑制p120E4F相互作用，導(dǎo)致Cyclin A基因的表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[17]。Cyclin A分別結(jié)合cdk2 和cdc2激酶調(diào)控細(xì)胞周期S期、G2/M期的過(guò)渡[18]， Cyclin B與p34cdc2激酶相關(guān)聯(lián)，直接參與G2/M期的過(guò)渡，是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的重要組成部分[19]。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控、主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺行為[20]，為程序性死亡。細(xì)胞增殖與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于生物個(gè)體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)維持、免疫耐受形成、惡性腫瘤的發(fā)生等有重要意義[21]。細(xì)胞凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，DNA斷裂是細(xì)胞凋亡晚期的重要特征[22]。研究表明[23]，HMGA2基因主要通過(guò)破壞DNA修復(fù)系統(tǒng)來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡。HMGA2能損傷DNA依賴蛋白酶的功能，損傷后可抑制非同源末端連接修復(fù)[24]，進(jìn)一步調(diào)控切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因的轉(zhuǎn)錄，最終抑制核酸切除修復(fù)[25]；此外，HMGA2能促進(jìn)共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張，加速Rad3相關(guān)激酶及其下游靶點(diǎn)激酶1的磷酸化，阻止G2/M期轉(zhuǎn)化，最終促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，使基因毒物不能危害到腫瘤細(xì)胞[26]。本研究我們采用了Annexin V-FITC及PI染色法并通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，HMGA2-siRNA組細(xì)胞凋亡率較Mock-siRNA組及未轉(zhuǎn)染組均顯著增加，提示HMGA2基因低表達(dá)可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡。本研究?jī)H通過(guò)siRNA敲低HMGA2 mRNA及蛋白表達(dá)，無(wú)法確認(rèn)細(xì)胞周期和凋亡等表型是由HMGA2直接影響的，未進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，也未增加更多的細(xì)胞系對(duì)本研究結(jié)果加以驗(yàn)證，有待在今后的工作中進(jìn)一步完善。

綜上所述，ACHN細(xì)胞被HMGA2-siRNA干擾后能達(dá)到基因沉默的目的，且能使ACHN細(xì)胞周期紊亂，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。提示HMGA2基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)能抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，是潛在的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。