婁永峰，宋曉琛，冷春暉，陳興彬，朱新傳，肖復(fù)明★

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330013；2.安?？h陳山林場(chǎng)，江西 安福343214)

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土針葉用材樹(shù)種，主要分布種植在長(zhǎng)江以南各省區(qū)。由于廣泛的種植區(qū)域和悠久的栽培歷史，杉木形成了一些優(yōu)良的變異類型，例如紅心杉、羅田垂枝杉等，其中紅心杉材質(zhì)堅(jiān)硬、色澤獨(dú)特，歷來(lái)受人們青睞。陳山紅心杉是紅心杉的典型代表，是江西地方特色杉木優(yōu)良種源，原產(chǎn)于江西省安福縣陳山林區(qū)，因其心材紅褐色且心材比例大而得名。目前有關(guān)陳山紅心杉的研究主要側(cè)重在良種選育、種苗繁育等方面，其種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳結(jié)構(gòu)分析等的相關(guān)研究較少。隨著陳山紅心杉種質(zhì)資源日益減少，對(duì)陳山紅心杉種質(zhì)資源的收集和保存工作就顯得極為重要，但迄今為止仍對(duì)陳山紅心杉種質(zhì)資源的基因遺傳結(jié)構(gòu)等知之甚少，以至于無(wú)法實(shí)施針對(duì)性保護(hù)策略。近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于杉木等林木種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等方面，例如，Chen等通過(guò)ISSR標(biāo)記分析了福建和臺(tái)灣兩地的杉木遺傳多樣性和變異[1]，Duan等利用SSR分子標(biāo)記分析了南方6省700份杉木優(yōu)樹(shù)種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建了核心種質(zhì)[2]。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記（Start codon targeted polymorphism,SCoT）是一種基于植物基因ATG起始密碼子兩側(cè)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)單引物并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，且擴(kuò)增產(chǎn)物可用簡(jiǎn)便的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)新型分子標(biāo)記[3]，其具有適用性廣、擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性高、獲得遺傳信息豐富，同時(shí)操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，可用于物種的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源的鑒定等方面，目前在五角楓（Acer mono）、柿（Diospyros kaki）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、羅漢松（Podocarpus macrophyllus）等多種植物中應(yīng)用[6-9]。

本研究以陳山紅心杉為材料，建立并優(yōu)化陳山紅心杉SCoT-PCR的反應(yīng)體系，篩選適合紅心杉的最佳PCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行引物篩選，為今后SCoT分子標(biāo)記在陳山紅心杉種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試陳山紅心杉種質(zhì)材料均來(lái)自江西安?？h陳山林區(qū)，在前期單株選優(yōu)的工作基礎(chǔ)上，采集優(yōu)樹(shù)新葉，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Collard和Mackill設(shè)計(jì)的SCoT分子標(biāo)記引物SCoT-01～SCoT-36，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。即用型常規(guī)PCR預(yù)混合溶液2×Hieff PCR Master Mix（以下簡(jiǎn)稱PCR Mix）、DL5000 DNA Marker、Agarose瓊脂糖等購(gòu)自翌圣生物科技（上海）有限公司。

1.2 基因組DNA提取和檢測(cè)

利用改良的CTAB法提取陳山紅心杉新葉DNA，同時(shí)瓊脂糖凝膠電泳（0.8%）進(jìn)行質(zhì)量分析，用微量分光光度計(jì)（Eppendorf BioSpectrometer basic）檢測(cè)其濃度，并將其定量至20.0 ng·μL-1，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SCoT-PCR體系正交設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

以SCoT-17為引物，陳山紅心杉DNA為模板，對(duì)影響陳山紅心杉SCoT-PCR反應(yīng)體系的模板DNA、PCR Mix和引物濃度等3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平，采用L16（43）正交試驗(yàn)（表1）。按比例將各試劑加入PCR管，然后用ddH2O補(bǔ)足至20.0μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5 min的預(yù)變性；95℃30 s的變性，55℃1 min的退火，72℃2 min的延伸，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min的總延伸，8℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍攝以備后續(xù)分析。體系優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 陳山紅心杉SCoT-PCR體系的單因素優(yōu)化

在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)模板DNA、PCR Mix和引物濃度等3個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步的單因素優(yōu)化，以確定陳山紅心杉SCoT-PCR的最優(yōu)體系。

1.5 陳山紅心杉SCoT引物的篩選

根據(jù)體系優(yōu)化的結(jié)果，在最優(yōu)反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，進(jìn)行陳山紅心杉SCoT引物篩選。首先隨機(jī)選取1個(gè)陳山紅心杉DNA對(duì)36條SCoT引物進(jìn)行初篩，選擇保留PCR擴(kuò)增條帶豐富、清晰的引物，然后隨機(jī)選取4個(gè)陳山紅心杉DNA對(duì)初篩獲得的引物進(jìn)行復(fù)篩，選擇保留多態(tài)性較高的引物。

1.6 數(shù)據(jù)分析

正交試驗(yàn)采用直觀分析法進(jìn)行分析，先根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶數(shù)量、清晰度等進(jìn)行評(píng)分，然后通過(guò)評(píng)分結(jié)果，計(jì)算出各個(gè)因素在各個(gè)水平的平均值Ki和極差R。

2 結(jié)果和分析

2.1 陳山紅心杉DNA質(zhì)量分析

利用改良CTAB法，提取陳山紅心杉基因組DNA，經(jīng)檢測(cè)其OD260/OD280值在1.8～2.0之間，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示（圖1），其主帶清晰，沒(méi)有明顯彌散、拖尾現(xiàn)象。這說(shuō)明DNA質(zhì)量好，純度高，可以用于后續(xù)分析。

圖1 DNA電泳分析Fig.1 The result of DNA electrophoresis

2.2 陳山紅心杉SCoT-PCR體系正交優(yōu)化分析

如圖2所示，在正交設(shè)計(jì)的16個(gè)組合中不同組合擴(kuò)增得到的條帶數(shù)量、條帶清晰度等差異較大，其中，組合9、10和13等擴(kuò)增較好，條帶數(shù)量豐富，且清晰亮度高，而組合4、8和16等擴(kuò)增條帶數(shù)量較少，且條帶清晰度較弱，效果不好。依據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)量、亮度和清晰度等指標(biāo)對(duì)3次重復(fù)分別進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分范圍在1～16之間，16個(gè)組合的3次重復(fù)的平均分值依次為：5.7、5.3、5.0、3.7、11.7、7.0、10.3、3.3、15.7、16.0、5.3、3.7、15.7、12.0、9.0、2.3，其中組合10獲得的分值最高，其PCR擴(kuò)增獲得的條帶數(shù)量、亮度和清晰度等均最佳，其相應(yīng)體系為：PCR Mix 10.0μL，模板DNA 3.0μL（60.0 ng），引物2.5μL（1.25μmol·L-1）。

直觀分析結(jié)果表明（表1），3個(gè)因素對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR的影響依次為PCR Mix＞引物濃度＞模板DNA。根據(jù)K值得出的最優(yōu)反應(yīng)體系為：PCR Mix 9.0μL，模板DNA 3.0μL（60.0 ng），引物2.5μL（1.25μmol·L-1），其與得分最高的組合10體系基本一致，僅PCR Mix用量上存在差異。

圖2陳山紅心杉SCoT-PCR體系正交優(yōu)化試驗(yàn)Fig.2 The Orthogonal test results of Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR

2.3 陳山紅心杉SCoT-PCR體系單因素優(yōu)化分析

為了進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，對(duì)模板DNA、PCR Mix和引物濃度這3個(gè)影響因素進(jìn)行單因素分析。

模板DNA量是影響特異性擴(kuò)增效率和擴(kuò)增產(chǎn)物量的一個(gè)重要因子。結(jié)果表明（圖3）：當(dāng)模板DNA量為10.0 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)量少，同時(shí)條帶亮度較低，當(dāng)模板DNA量在20.0～80.0 ng之間時(shí)，其擴(kuò)增條帶數(shù)量均比較豐富，且亮度高清晰，說(shuō)明模板DNA量對(duì)反應(yīng)體系影響較小，這與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)直觀分析的結(jié)果相符。因此模板DNA量在20.0～80.0 ng均可。

圖3模板DNA量對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR體系的影響Fig.3 The effect of DNA concentration on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

PCR Mix含有dNTP、Mg2+、Taq酶等，這3種試劑對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響較大，因此對(duì)PCR Mix用量進(jìn)行優(yōu)化十分必要。結(jié)果顯示：隨著用量的增加，擴(kuò)增條帶數(shù)量、亮度等的綜合表現(xiàn)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)用量為8.0～11.0μL時(shí)，其擴(kuò)增條帶數(shù)目較多且清晰明亮，其中PCR Mix用量為9.0μL時(shí)最佳（圖4）。

表1陳山紅心杉SCoT-PCR體系優(yōu)化正交設(shè)計(jì)及分析Tab.1 The Orthogonal design L 16(43)and analysis of Redheart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

圖4 PCR Mix用量對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR體系的影響Fig.4 The effect of the amount of PCR Mix on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

此外，引物濃度也是直接影響SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果的一個(gè)重要因素。在8個(gè)不同的水平中，隨著引物濃度的增加，其擴(kuò)增效果也呈現(xiàn)出先揚(yáng)后抑的形式，當(dāng)引物濃度為0.25～0.50μmol·L-1時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶較少，且部分條帶暗淡不清晰；當(dāng)其濃度增加至0.75～1.50μmol·L-1時(shí)，PCR擴(kuò)增條明顯帶增多，且條帶的明亮和清晰度也相應(yīng)提高；而引物濃度持續(xù)增加至1.75～2.00μmol·L-1時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶又出現(xiàn)缺失，因此確定1.50μmol·L-1為引物的最佳濃度（圖5）。

圖5引物濃度對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR體系的影響Fig.5 The effect of the concentration primer on Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system

綜合考慮正交設(shè)計(jì)和單因素優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合得出SCoT-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系為：模板DNA 2.5μL（50.0 ng），PCR Mix 9.0μL，引物3.0μL（即濃度1.5 μmol·L-1），ddH2O補(bǔ)足至20.0μL。以隨機(jī)選擇的20個(gè)陳山紅心杉DNA為模板，同時(shí)隨機(jī)選取SCoT引物對(duì)優(yōu)化獲得的SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示：在該體系下，PCR擴(kuò)增條帶清晰明了，易于判斷，多態(tài)性較高，這表明該體系穩(wěn)定性好，通用性強(qiáng)，適用陳山紅心杉SCoT分子標(biāo)記分析。

圖6陳山紅心杉SCoT-PCR最優(yōu)體系驗(yàn)證（引物SCoT-35）Fig.6 Verification of the optimal Red-heart C.lanceolata SCoT-PCR reaction system(SCoT-35)

2.4 陳山紅心杉SCoT引物篩選

利用優(yōu)化的SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行SCoT引物篩選，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，從36條SCoT引物中共篩選獲得14條擴(kuò)增條帶豐富明亮且多態(tài)性較強(qiáng)的引物，可用于后續(xù)陳山紅心杉SCoT標(biāo)記分析（圖7）。

圖7 SCoT引物的復(fù)篩Fig.7 The screening of SCoT primer

3 結(jié)論與討論

SCoT是由Collard和Mackill開(kāi)發(fā)的一種簡(jiǎn)單新穎的DNA分子標(biāo)記[3]。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)與單因素設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行建立和優(yōu)化，結(jié)果獲得了適合于陳山紅心杉的SCoT-PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2.5μL（50.0 ng），PCR Mix 9.0μL，引物3.0μL（即濃度1.5μmol·L-1），ddH2O補(bǔ)足至20.0μL；而各因素對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR體系影響順序?yàn)镻CR Mix＞引物濃度＞模板DNA，這和耿睿曼等[10]的研究結(jié)果類似。PCR Mix含有Taq酶、Mg2+、dNTP等，在PCR反應(yīng)中，Taq酶是最關(guān)鍵的因素，其濃度過(guò)高會(huì)引起PCR的非特異性擴(kuò)增，而過(guò)低則會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果[11]；Mg2+直接影響Taq酶活性，并且能影響引物與模板DNA的結(jié)合，其濃度過(guò)高可能會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，而過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量[12]；dNTPs作為PCR反應(yīng)的底物，當(dāng)其濃度過(guò)高，會(huì)影響堿基錯(cuò)配，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增效果[13]。在引物濃度和模板DNA這兩個(gè)因素中，引物濃度對(duì)陳山紅心杉SCoT-PCR反應(yīng)體系的影響較模板DNA對(duì)其的影響大。一般PCR反應(yīng)體系中引物濃度過(guò)高則會(huì)促使PCR發(fā)生非特異性擴(kuò)增，而濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量，而模板DNA在其質(zhì)量得到保障的前提下其對(duì)反應(yīng)的影響較小[14]。

本研究初步建立及優(yōu)化獲得了陳山紅心杉SCoT-PCR反應(yīng)體系，并在其有效的驗(yàn)證基礎(chǔ)上利用該反應(yīng)體系篩選了14條適合于陳山紅心杉SCoT標(biāo)記分析的引物，這為今后利用SCoT分子標(biāo)記研究陳山紅心杉遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定等研究奠定了基礎(chǔ)。