蘭玉菲 孔 怡* 于清偉 馬為勇 崔 曉

（1泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東泰安271000；2泰安市寧陽縣華豐鎮(zhèn)農(nóng)技站，山東泰安271413）

靈芝屬Ganoderma真菌是重要的藥用真菌，隸屬于真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌亞門（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），在我國已有悠久的應(yīng)用歷史[1]。

近年來山東省靈芝生產(chǎn)發(fā)展迅速，種質(zhì)資源也在不斷豐富，但目前對(duì)靈芝屬種質(zhì)資源的遺傳背景和遺傳多樣性缺少系統(tǒng)研究。因此，筆者對(duì)山東省栽培靈芝菌株的遺傳多樣性進(jìn)行研究，明確了27個(gè)栽培靈芝屬菌株的分類地位，為靈芝屬種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳改良和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試靈芝菌株

供試的27個(gè)靈芝菌株中ZL81來自四川中醫(yī)藥科學(xué)院，紫芝、園芝1號(hào)來自壽光食用菌研究所，其他24個(gè)菌株均來自泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。具體編號(hào)見表1。

表1 試驗(yàn)靈芝屬菌株及編號(hào)

1.2 主要試劑與儀器

真菌總DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。My Cycle PCR儀，美國伯樂儀器公司。

1.3 供試培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基：配方參照文獻(xiàn)[2]。

1.4 菌絲體制備

切取保存在PDA加富斜面培養(yǎng)基上的菌絲純培養(yǎng)5 mm2，接種于PDA加富平板培養(yǎng)基中央，25℃暗培養(yǎng)5～7 d，待菌絲接近生長至平板邊緣后，刮取菌絲體用于基因組DNA的提取。

1.5 DNA的提取

利用DNA提取試劑盒提取真菌總DNA。具體步驟參照文獻(xiàn)[3]。提取的總DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ITS擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[4]用于真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[3]。

表2 PCR擴(kuò)增ITS所用引物的核苷酸序列

1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取4μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序。

1.8 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行Blast檢索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 6.06軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較和分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳距離分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS擴(kuò)增

以提取的27個(gè)靈芝菌株總DNA為模板，用真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得27個(gè)靈芝屬菌株的ITS序列，長度約為600 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致。

圖1 部分靈芝菌株核糖體ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 ITS序列分析

測(cè)序獲得27個(gè)菌株的ITS序列片段，測(cè)得的菌株序列提交到GenBank并獲得登錄號(hào)（表3）。根據(jù)GenBank中已有靈芝屬菌株的ITS序列資料，確定ITS序列的ITS1、5.8S和ITS2的序列范圍。供試靈芝屬菌株的ITS序列的長度變異較大，G.lingzhisp.nov.ITS序列長度為542 bp，G.applanatumITS序列長度為560 bp，G.sienseITS序列長度為555 bp。

表3 27個(gè)靈芝屬菌株ITS序列的登錄號(hào)

2.3 聚類分析

根據(jù)MEGA6.06軟件中的Neighbour-Joining methods，以樟芝（Autrodia comphorata）作為外類群，對(duì)27個(gè)測(cè)得的和26個(gè)來自GenBank的ITS序列進(jìn)行聚類分析，建立基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，山東省栽培靈芝菌株分布于3個(gè)聚類組（Ⅰ組、Ⅳ組和Ⅴ組）。Ⅰ組為G.lingzhisp.nov.，包括35個(gè)菌株，均來自東亞地區(qū)（其中2個(gè)菌株來自日本，其余菌株分別來自中國的遼寧省、河南省、安徽省、湖北省、廣東省、浙江省、四川省、山東省、福建省和江蘇?。?3個(gè)供試菌株均聚于該組，為山東省主要栽培菌株，組內(nèi)各菌株間核苷酸一致率在99.26%～100.00%。Ⅱ組為G.multipileum，包括3個(gè)菌株，均來自亞洲熱帶地區(qū)。Ⅲ組為G.lucidum，包括4個(gè)菌株，來自歐洲大陸。Ⅳ組為G.applanatum，包括5個(gè)菌株，供試菌株P(guān)CSS、FCSS和YXSS聚于該組，該組內(nèi)菌株核苷酸一致率非常高，PCSS、YXSS與GenBank中的2個(gè)菌株（DQ425009、DQ424996）核苷酸一致率達(dá)100%，F(xiàn)CSS與其他4個(gè)菌株的核苷酸一致率為99.82%；Ⅴ組為G.siense，包括3個(gè)菌株，供試ZZ菌株聚于該組，與來自上海市（DQ424982）、福建省（HQ235633）的2個(gè)菌株核苷酸一致率分別為99.28%、99.64%。結(jié)果表明，利用ITS區(qū)能夠有效準(zhǔn)確地將山東省栽培靈芝菌株分成G.lingzhisp.nov.、G.applanatum和G.siense三大類群，而與來自歐洲的G.lucidum親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，明確了山東省栽培靈芝菌株的分類地位。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 基于DNA序列的種間種內(nèi)遺傳距離分析

根據(jù)MEGA6.06軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類情況，對(duì)所有菌株進(jìn)行分組，計(jì)算種間種內(nèi)遺傳距離。由表4可以看出，靈芝屬5個(gè)不同種種間遺傳距離的變化在0.039～0.101，表明他們之間的遺傳關(guān)系比較遠(yuǎn)；而種內(nèi)遺傳距離的變化在0.000～0.003，說明種內(nèi)不同菌株間的遺傳距離都比較小，表明種內(nèi)菌株之間的遺傳關(guān)系較近，并且遺傳進(jìn)化過程中遺傳信息流動(dòng)可能發(fā)生較頻繁。

表4 基于DNA序列的種間種內(nèi)遺傳距離分析

3 小結(jié)

靈芝屬Ganoderma真菌為中國傳統(tǒng)的藥用真菌，具有扶正固本，提高機(jī)體免疫力等多種功能。靈芝因其突出的保健作用、不斷發(fā)現(xiàn)新藥用功效而成為科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。然而靈芝屬的分類比較混亂，過去一直將來自東亞的靈芝“Lingzhi”歸為G.lucidum（起源于歐洲）。2012年，Cao等利用rDNA nuc-ITS，結(jié)合mt-SSU，RPB1，RPB2和TEF1-α對(duì)來自世界不同地區(qū)的靈芝菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，明確“Lingzhi”的分類地位，并提出來自東亞的“Lingzhi”屬于一個(gè)新種G.lingzhi，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別[5]。

筆者對(duì)獲得的27個(gè)ITS序列、26個(gè)來自GenBank的ITS序列進(jìn)行聚類分析，建立基于ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，23個(gè)供試菌株均聚于G.lingzhi，其余4個(gè)菌株聚于G.applanatum和G.siense，結(jié)果與Cao等（2012）一致。

研究從DNA水平上對(duì)山東省栽培靈芝菌株的遺傳多樣性進(jìn)行研究，明確了靈芝屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和分子特征，為靈芝屬種質(zhì)資源遺傳改良、新品種的選育奠定分子基礎(chǔ)，同時(shí)為特異種質(zhì)的鑒定提供了有效方法。