孫 波 周洪英 趙會(huì)長(zhǎng) 王卓仁 劉啟燕 吳洪麗

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北武漢430064）

裂褶菌Schizophyllum commune，別名白參、樹花，屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、裂褶菌科、裂褶菌屬。裂褶菌是一種食藥用菌，有鎮(zhèn)靜，治療神經(jīng)衰弱、精神不振、頭昏耳鳴、虛汗，緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的作用[1-2]。筆者對(duì)一株野生裂褶菌進(jìn)行分離鑒定培養(yǎng)，并探索該菌株馴化培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步研究開發(fā)該菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為2020年6月筆者在湖北省武漢市江灘上的櫻花樹干上采集的野生裂褶菌（Schizophyllumsp.）子實(shí)體。

1.2 主要儀器與試劑

Thermo Sorvall Biofuge Primo R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），TaKaRa TP600型PCR儀（Taka ra生物株式會(huì)社），NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司），ABI3730-XL型測(cè)序儀（Applied Biosystems美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司），Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司），DNA marker（Taka ra生物株式會(huì)社），葡萄糖、蛋白胨、瓊脂為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂18～20 g，水1 000 mL，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL，pH自然。

桑枝屑培養(yǎng)基：桑枝屑80%，麩皮18%，糖1%，石膏1%，料含水量60%～65%。采用規(guī)格為14 cm×26 cm×0.005 cm的聚丙烯折角袋裝料，用套環(huán)防水蓋封口，121℃滅菌2 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 野生裂褶菌菌株分離鑒定

取野生裂褶菌子實(shí)體，無(wú)菌水沖洗后用無(wú)菌濾紙吸干水，將菌褶向下放在無(wú)菌玻璃平板上，26℃靜置24～48 h。有大量孢子落下形成白色孢子印后，取孢子接種到PDA平板培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)得到純培養(yǎng)菌株后轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)至菌絲滿管，置4℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。

取純培養(yǎng)菌株，采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）分析對(duì)其進(jìn)行分子鑒定[4]。提取真菌基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收。取純化后的PCR產(chǎn)物，用ABI3730-XL測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。用NCBIBlast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募c美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息。

1.4.2 馴化前后裂褶菌菌株菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

取純培養(yǎng)菌株和馴化培養(yǎng)7代菌株，分別接種至PDA平板中央，26℃培養(yǎng)，待菌塊萌發(fā)并長(zhǎng)出約0.5 cm后，在菌落邊緣劃線（起始線），繼續(xù)培養(yǎng)10 d，劃終止線，測(cè)量起始線與終止線間的距離。菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）=起始線與終止線間的距離/菌絲生長(zhǎng)的時(shí)間。

1.4.3 野生裂褶菌馴化培養(yǎng)及出菇試驗(yàn)

用桑枝屑培養(yǎng)基進(jìn)行裂褶菌菌株馴化培養(yǎng)。取純培養(yǎng)菌株接入桑枝屑培養(yǎng)基中，26℃避光培養(yǎng)，測(cè)定記錄菌絲生長(zhǎng)速度和濃密程度，再取菌絲生長(zhǎng)前端接入下一級(jí)培養(yǎng)基中，再測(cè)定記錄菌絲生長(zhǎng)速度和濃密程度，以此類推，分別取各級(jí)菌株進(jìn)行馴化培養(yǎng)。

取馴化7代后的菌株接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量150 mL）中，26℃、150 r/min搖床培養(yǎng)10 d，發(fā)酵液5 000 r/min離心收集菌絲體，用水清洗3次，烘干稱重得菌絲體生物量。

取馴化7代后菌株接入桑枝屑料袋，26℃培養(yǎng)30～35 d，菌絲滿袋后，再培養(yǎng)7～10 d進(jìn)行出菇管理，10～15 d后可采收[5]。記錄子實(shí)體單重，計(jì)算生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生裂褶菌菌株分離鑒定結(jié)果

在活的櫻花樹上采集的野生裂褶菌子實(shí)體，叢生，顏色灰白色，單片呈扇形（10 mm×17 mm），根據(jù)形態(tài)初步鑒定為裂褶菌屬（Schizophyllum），如圖1。采用ITS分析法對(duì)孢子分離法得到的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行分子鑒定，比對(duì)結(jié)果顯示，Schizophyllum commune與待測(cè)物種序列最大相似度為99.83%。

圖1 野生裂褶菌子實(shí)體

2.2 野生裂褶菌馴化培養(yǎng)前后菌絲生長(zhǎng)比較結(jié)果

野生裂褶菌未經(jīng)馴化前，在平板上生長(zhǎng)菌絲呈棉絮狀、稀疏，菌落不規(guī)則，可見(jiàn)部分菌絲扭結(jié)形成菌核（圖2），菌絲向周圍生長(zhǎng)擴(kuò)散的速度較慢，菌絲平均長(zhǎng)速僅2 mm/d。馴化培養(yǎng)7代后，菌絲狀態(tài)與馴化前差異明顯，菌絲濃密，呈棉絮狀，菌苔增厚，菌絲密度增大，未見(jiàn)菌絲扭結(jié)形成菌核（圖3），菌絲平均生長(zhǎng)速度達(dá)3.1 mm/d。

圖2 馴化前野生裂褶菌菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)

圖3 馴化7代后野生裂褶菌菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)

2.3 馴化培養(yǎng)及出菇試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，隨著菌株轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，菌絲在桑枝屑培養(yǎng)基中生長(zhǎng)逐漸濃密，平均生長(zhǎng)速度呈加快趨勢(shì)，最終（馴化7代）為7.0～7.3 mm/d。馴化7代的裂褶菌菌株接入液體培養(yǎng)基中，26℃，150 r/min搖床培養(yǎng)10 d，菌絲體生物量達(dá)17.3 g/L。馴化7代后的裂褶菌菌株袋料栽培結(jié)果，可采收2潮子實(shí)體，2潮子實(shí)體的外觀形態(tài)無(wú)明顯差異，第1潮、第2潮平均單菇重分別為20.7 g、12.9 g，生物學(xué)效率為16.8%。

圖4 馴化后野生裂褶菌菌株在桑枝屑培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度

圖5 馴化7代后栽培的子實(shí)體

3 小結(jié)與討論

采用孢子分離法分離培養(yǎng)活櫻花樹上采集的野生裂褶菌，得到純培養(yǎng)菌株，經(jīng)ITS序列分析，鑒定為Schizophyllum commune。采用桑枝屑培養(yǎng)基連續(xù)馴化培養(yǎng)表明，轉(zhuǎn)接次數(shù)增加，菌絲生長(zhǎng)逐漸濃密，平均生長(zhǎng)速度加快，生物學(xué)效率達(dá)16.8%。

試驗(yàn)只進(jìn)行了野生裂褶菌分離鑒定及初步馴化培養(yǎng)，并未對(duì)其液體培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，今后可進(jìn)一步細(xì)化培養(yǎng)條件及出菇管理，為提高生物學(xué)效率和菌絲體生物量奠定基礎(chǔ)。