劉瑞蓮，屈紅林，陳伊琳，毛海峰

抑郁癥是一種患病率、復(fù)發(fā)率和自殺率較高的精神類疾病，嚴(yán)重影響機(jī)體健康，給社會、家庭和個人造成巨大危害，雖然有大量學(xué)者提出炎癥反應(yīng)[1]、神經(jīng)營養(yǎng)因子異常[2]、DNA 甲基化調(diào)控、去甲腎上腺素學(xué)說[3]、五羥色胺（5-HT）學(xué)說[4]、神經(jīng)通路學(xué)說，以及遺產(chǎn)因素、神經(jīng)生化因素和心理社會因素的假說，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。當(dāng)前臨床上多采用藥物治療、心理療法、物理治療、中醫(yī)治療等方法，治療起效慢、應(yīng)答率低、治愈率低的現(xiàn)狀已經(jīng)使其成為當(dāng)今全世界的重大難題之一，已有較多研究結(jié)果顯示，通過運(yùn)動對抑郁癥進(jìn)行干預(yù)具有明顯的優(yōu)勢，但其作用機(jī)制的研究尚處于起步階段。V.KRISHNAN等[5-6]證實抑郁癥發(fā)病過程中存在明顯的海馬區(qū)域神經(jīng)元凋亡與萎縮現(xiàn)象，研究指出神經(jīng)元凋亡誘導(dǎo)的海馬組織損傷可能是誘發(fā)抑郁癥患者器質(zhì)性病變的基礎(chǔ)之一[7]。作為應(yīng)激性損傷的主要靶器官的海馬是記憶、學(xué)習(xí)和情緒控制的重要區(qū)域，其損傷通常造成空間記憶缺失、方位定向錯誤。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序化死亡[8]，主要參與細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育、正常細(xì)胞更新以及某些疾病的病理改變[9-10]，其中海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡已經(jīng)在抑郁癥患者與動物實驗的海馬病理改變中得以驗證[11-12]。有氧運(yùn)動抗海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡已經(jīng)在阿爾茨海默病[13]、血管性癡呆[14]等神經(jīng)損傷類，糖尿病[15]、肥胖癥[16]等代謝類疾病，以及有氧運(yùn)動促進(jìn)藥物治療抑郁癥等方面得以證實[17]。課題組前期的實驗研究[18]已證實有氧運(yùn)動可通過激活BDNF及其miR-195的靶向調(diào)控發(fā)揮抗凋亡作用改善抑郁小鼠海馬功能，但具體的作用機(jī)制尚不深入。在前期項目研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析方法篩選出運(yùn)動干預(yù)海馬神經(jīng)凋亡的機(jī)制與5-HT、Bcl-2、Caspase-3 和PARP 等的差異表達(dá)可能密切相關(guān)，本研究擬通過驗證有氧運(yùn)動改善抑郁小鼠海馬5-HT、Bcl-2、Caspase-3 和 PARP 的變化，探討 Bcl-2/Caspase-3/PARP 信號通路參與有氧運(yùn)動改善抑郁癥小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

SPF 級健康雄性 8 周齡 KM 小鼠 36 只，體重 25～30 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK湘2016-0002。所有小鼠在室溫（25±1）℃，相對濕度為50%的環(huán)境中自由飲水、標(biāo)準(zhǔn)飲食。36 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為3 組（n=12）：空白對照組（Control 組，CG）、不可預(yù)知性應(yīng)激模型組（CUMS 組，MG）和造模運(yùn)動干預(yù)組（CUMS+Exercise組，CE）。

1.2 抑郁模型構(gòu)建與判定

MG 組和CE 組小鼠借鑒相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，采用28天慢性不可預(yù)見性應(yīng)激刺激構(gòu)建抑郁模型，即選用包括晝夜調(diào)整、禁食、禁水、傾斜鼠籠、改變光照性質(zhì)、潮濕墊料、溫水游泳、低溫游泳、水平震蕩、束縛、白噪音等在內(nèi)的13 種應(yīng)激方式，按每天2～3 種刺激方式隨機(jī)數(shù)字法生成刺激方案，為避免因相同刺激引起的適應(yīng)性，微調(diào)刺激方案，確保相鄰時間不重復(fù)刺激方式。

神經(jīng)行為學(xué)評定。糖水偏好指數(shù)（sucrose preference test，SPT）：P.WILLNER 等[21]的研究提出糖水偏好指數(shù)下降可作為評價抑郁模型的核心指標(biāo)，其可用于評價實驗小鼠的快感缺失。測試時，先適應(yīng)性訓(xùn)練小鼠含糖飲水。適應(yīng)期后，禁食禁水10 h 后，每只小鼠的鼠籠放置2 個水瓶，分別為蒸餾水和含1%蔗糖的蔗糖水[22-23]，200 mL/瓶，供小鼠自由飲水，30 min 后交換兩瓶水的位置，實驗1 h 后稱取兩瓶水中的重量，計算蔗糖偏好指數(shù)（%）。糖水偏好指數(shù)與動物的快感程度呈正相關(guān)，其值越小則表明動物快感缺失越嚴(yán)重[24]。與空白對照組，糖水偏好指數(shù)呈顯著性減小，即可判定為抑郁造模成功。強(qiáng)迫游泳（forced swimming test，F(xiàn)ST）：測試時將小鼠單獨(dú)放置于直徑為10 cm 的強(qiáng)迫游泳儀玻璃缸中，水深30 cm，水溫（25±2）℃，計時6 min，記錄后4 min 內(nèi)游泳累計不動時間。強(qiáng)迫游泳時間越長，抑郁癥狀也就越嚴(yán)重[25]。

1.3 有氧運(yùn)動方案

CE 組小鼠在造模評定完成后，次日進(jìn)行適應(yīng)性跑臺運(yùn)動，適應(yīng)性訓(xùn)練按照0坡度，10 m/min的速度訓(xùn)練10 min，之后每天遞增10 min，直到60 min。間歇一天后，參照T.G.BEDFORD[26]改良訓(xùn)練方案進(jìn)行中低強(qiáng)度正式訓(xùn)練，即按照0坡度、10 m/min，60 min/天，每周6天，連續(xù)訓(xùn)練8周。

1.4 樣本處理

所有小鼠禁食過夜。次日以1%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，每組隨機(jī)選取6 只小鼠進(jìn)行腦在體固定，腦固定完成后，冰上剝離顱骨，取出腦組織于4%的多聚甲醛固定48 h 以上；另外6 只小鼠冰浴下分離小鼠海馬組織，稱重后分兩管，左側(cè)海馬用于Western blot檢測，右側(cè)海馬用于提取總RNA，用于 RT-PCR 檢測。 ELISA 試劑盒購自 ABclonal（USA），兔抗多克隆抗體 Bcl-2、BDNF、APRP、5-HT購自CUSABIO，PCR mRNA 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計。

1.4.1 海馬組織Nissl 染色 固定好的腦組織石蠟包埋，全自動切片機(jī)下沿冠狀面切出厚度為5 μm 的切片。切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、染色、沖洗、脫水、分色、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)并拍照。

1.4.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 實驗選用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。石蠟切片同上，切片二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、蛋白酶K 工作液37 ℃反應(yīng)30 min，PBS漂洗、室溫固定30 min，浸入封閉液室溫封閉10 min，PBS 漂洗后標(biāo)記反應(yīng)。先用TdT 酶反應(yīng)液37 ℃避光反應(yīng)1 h，SSC 室溫15 min終止反應(yīng)，PBS 漂洗，浸入0.3% H2O2PBS 中封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育5 min，PBS 漂洗，Streptavidin-HRP工作液37 ℃反應(yīng)1 h，PBS漂洗后DAB顯色，選擇性進(jìn)行復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察計數(shù)黃褐色陽性細(xì)胞數(shù)。計數(shù)時每組隨機(jī)選取6只小鼠的切片，每片隨機(jī)選取5個視野計數(shù)陽性染色細(xì)胞數(shù)。

1.4.3 免疫熒光檢測5-HT、PARP 石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水、抗原修復(fù)、PBST 漂洗，BSA 試劑37 ℃濕盒封閉20 min，抗體染色，4 ℃孵育過夜，一抗對應(yīng)種屬的熒光二抗工作液，室溫避光孵育1 h，滴加含有DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.4 Western blot檢測Bcl-2、PARP和Caspase-3的蛋白表達(dá) 海馬組織冰上勻漿器勻漿后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白裂解液提取總蛋白，酶標(biāo)儀測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白濃度定量為2μg/μL。等量蛋白質(zhì)上樣，電泳分離、轉(zhuǎn)膜，3%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜，TBST 漂洗、二抗室溫孵育 1 h，TBST 清晰，ECL曝光顯影。Image J圖像分析，目的蛋白與β-actin內(nèi)參灰度比值測定蛋白水平。

1.4.5 RT-PCR 檢測相關(guān)基因表達(dá) 分離海馬后，冰浴電動勻漿器勻漿裂解白細(xì)胞，苯酚氯仿法提取總RNA，超微量紫外分光光度計檢測總RNA濃度/純度，Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，兩步法RT-PCR檢測海馬組織mRNA的差異表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計算海馬組織基因表達(dá)水平。相關(guān)引物經(jīng)NCBI Blast 基因庫檢索核驗后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成、純化。其引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 The Gene Primers

1.5 數(shù)理處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計分析軟件對原始實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，實驗數(shù)據(jù)差異性檢驗采用ANOVA 方差分析，針對不呈正態(tài)分布的相關(guān)數(shù)據(jù)，組間比較采用卡方檢驗，符合正態(tài)分布的相關(guān)數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis 檢驗，P〈0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評定結(jié)果

與CG 相比MG 小鼠糖水偏好指數(shù)顯著降低（P〈0.01），強(qiáng)迫游泳不動時間明顯延長（P〈0.01）；與MG相比，CE 小鼠的糖水偏好指數(shù)顯著升高（P〈0.01），強(qiáng)迫游泳不動時間顯著縮短（P〈0.01）（見表2）。

表2 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)評定結(jié)果（n=12）Table2 The Evaluation Results of Aerobic Exercise Intervention CUMS Depression Mice Neurobehavioral（n=12）

2.2 小鼠海馬Nissl染色檢測結(jié)果

Nissl 染色的結(jié)果可以看到正常小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可見清晰、顆粒狀尼氏體，且神經(jīng)元分布均勻，胞漿飽滿；與CG 相比，MG 小鼠海馬神經(jīng)元排列稀疏，伴有神經(jīng)元丟失，細(xì)胞間隙增寬，尼氏體核固縮、變窄，著色變淺，這與郭純等[27]的研究結(jié)果相似；運(yùn)動干預(yù)后的抑郁小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目增多，雖然仍有核固縮現(xiàn)象，但核固縮現(xiàn)象減少，染色趨于清晰（見圖1）。

圖1 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬組織Nissl染色結(jié)果（×400）Figure1 The Nissl Staining Results of Aerobic Exercise Interven‐tion Hippocampus in CUMS Depressed Mice.（×400）

2.3 有氧運(yùn)動干預(yù)CUMS 抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡

與CG 相比，TUNEL 法細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（P〈0.01）；與MG 相比，CE 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著降低（P〈0.05）（見表3）。

表3 有氧運(yùn)動對抑郁模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（n=6）（×100）Table3 Effect of Aerobic Exercise on Neurons Apoptosis in Hip‐pocampus Area in Mice Model of Depression（n=6）（×100）

2.4 小鼠海馬免疫熒光檢測結(jié)果

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與CG 相比，MG 小鼠海馬5-HT 表達(dá)強(qiáng)度降低（P〈0.05），PARP 表達(dá)強(qiáng)度升高（P〈0.05）；與MG 相比，CE 小鼠海馬組織5-HT 表達(dá)強(qiáng)度升高，PARP 表達(dá)強(qiáng)度降低，均呈顯著性差異（P〈0.05）。

2.5 小鼠海馬組織Western blot檢測結(jié)果

與CG 小鼠海馬組織Western blot 的檢測結(jié)果相比，MG 小鼠 Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著下降（P〈0.05），Caspase-3、PARP 蛋白表達(dá)量顯著上升（P〈0.05），有氧運(yùn)動可顯著增加抑郁小鼠海馬的Bcl-2蛋白表達(dá)量（P〈0.01），降低PARP 的蛋白含量（P〈0.05），所不同的是CE 組小鼠海馬組織Caspase-3 的蛋白表達(dá)量雖下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P〉0.05）（見圖2）。

圖2 有氧運(yùn)動干預(yù)抑郁小鼠海馬組織蛋白含量的檢測分析結(jié)果（蛋白/β-actin，n=6）Figure 2 The Results of Aerobic Exercise Intervention on the Protein Content of Hippocampus in Depressed Mice.（Protein/βactin，n=6）

2.6 小鼠海馬組織RT-PCR檢測結(jié)果

與 CG 相比，MG 小鼠海馬組織 5-HT、Bcl-2 表達(dá)水平明顯下調(diào)（P〈0.05、P〈0.01），Caspase-3、PARP（P〈0.01）顯著上調(diào)（P〈0.05、P〈0.01）；與MG 相比，有氧運(yùn)動干預(yù)后抑郁小鼠海馬組織5-HT 與Bcl-2 表達(dá)明顯上調(diào)（P〈0.01），Caspase-3（P〈0.05）與 PARP（P〈0.01）表達(dá)水平顯著性下調(diào)。

3 分析與討論

3.1 實驗小鼠抑郁造模及運(yùn)動干預(yù)效果分析

實驗中對造模小鼠采用機(jī)體無外傷性刺激的慢性不可預(yù)見性刺激因素與抑郁癥患者身心疾病的致病過程有較高的形似性，且具有高效、抑郁狀態(tài)持續(xù)時間長等特點(diǎn)，成為經(jīng)典的抑郁實驗動物造模方法[28]。本實驗通過28 天的抑郁造模，結(jié)果顯示MG 小鼠糖水偏好指數(shù)顯著下降，強(qiáng)迫游泳不動時間顯著延長，Nissl染色結(jié)果可見明顯的神經(jīng)元萎縮和核固縮現(xiàn)象，5-HT 的蛋白含量和基因表達(dá)量均顯著降低，這與P.W.ANDREWS 等證實抑郁期間腦細(xì)胞間隙內(nèi)5-HT的低濃度密切相關(guān)[29-30]。提示實驗抑郁造模小鼠的快感缺失，神經(jīng)行為學(xué)和病理學(xué)改變明顯，并伴有抑郁癥患者海馬組織5-HT 顯著下降的典型表現(xiàn)，足以證實抑郁造模效果顯著。5-HT 作為腦內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)[31]，廣泛分布于大腦皮層和神經(jīng)突觸內(nèi)，為自體活性物質(zhì)，可使機(jī)體產(chǎn)生愉悅感，其含量與抑郁病理改變關(guān)系密切[32-33]。實驗結(jié)果表明，有氧運(yùn)動可提升CUMS 抑郁小鼠糖水偏好指數(shù)，改善其快感缺失的抑郁樣行為，縮短強(qiáng)迫游泳的不動時間，增加其求生欲望。有氧運(yùn)動還可以增加CUMS 抑郁小鼠海馬組織5-HT 的蛋白含量，上調(diào)5-HT mRNA 的表達(dá)，具有顯著性差異。神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)和功能單位，尼氏體是其特征性結(jié)構(gòu)之一，廣泛存在于神經(jīng)元胞體和樹突。Nissl染色結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動可改善海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞形態(tài)，降低神經(jīng)元萎縮，減少核固縮等病理改變[34]。

3.2 有氧運(yùn)動干預(yù)抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)抗凋亡因子的差異表達(dá)結(jié)果分析

本實驗的TUNEL 檢測結(jié)果顯示，MG 較 CG 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加，這與以往的文獻(xiàn)報道較為相似[35]。為期8 周的有氧運(yùn)動干預(yù)后，能夠顯著降低抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，雖然與CG 相比，仍具有顯著性差異，但已經(jīng)明顯呈現(xiàn)出較好的恢復(fù)趨勢。相關(guān)研究已經(jīng)顯示，抑郁病理性改變可誘導(dǎo)海馬組織Bcl-2 蛋白含量下降，導(dǎo)致其作為重要的抗凋亡因子和細(xì)胞存活促進(jìn)因子，阻止細(xì)胞色素由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)的能力下降[36]。Bcl-2可穩(wěn)定線粒體，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，調(diào)節(jié)線粒體信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，中斷DNA 凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受凋亡損傷[37-38]。本實驗的結(jié)果也顯示抑郁小鼠海馬組織Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，有氧運(yùn)動能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA 表達(dá)，改善慢性應(yīng)激性刺激導(dǎo)致的抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞血氧和營養(yǎng)供應(yīng)，從而改善抑郁癥狀。

3.3 有氧運(yùn)動誘導(dǎo)Bcl-2-Caspase-3/PARP信號通路干預(yù)抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析

Caspase-3 是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶[39]，可通過酶解滅活凋亡抑制物、細(xì)胞外基質(zhì)及骨架蛋白，裂解DNA 修復(fù)分子等啟動Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[40]。本實驗同其他實驗研究結(jié)果相似，慢性應(yīng)激抑郁實驗動物海馬組織Caspase-3 蛋白水平升高，基因表達(dá)上調(diào)，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡[41-42]。作為Caspase-3作用底物的PARP 是一種DNA 損傷傳感器，是典型的蛋白質(zhì)翻譯的后修飾酶，對DNA 斷端十分敏感。正常情況下，活性較低的PARP 與DNA 斷裂端關(guān)系密切[43]，能識別DNA 缺口并與之結(jié)合到多種核蛋白，比如DNA聚合酶、組蛋白、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶及轉(zhuǎn)錄因子等，調(diào)節(jié)多種生理過程[44]；病理狀態(tài)下，DNA損傷嚴(yán)重時，細(xì)胞內(nèi)PARP 被大量激活，致使多聚ADP 核糖積聚，凋亡誘導(dǎo)因子核轉(zhuǎn)位等一系列病理改變，進(jìn)一步誘導(dǎo)DNA 斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與相關(guān)凋亡、自噬研究的結(jié)果相一致[45]，本實驗發(fā)現(xiàn)抑郁小鼠海馬組織存在明顯的Caspase-3 及其底物PARP mRNA 表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白含量增加，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA 表達(dá)下調(diào)，提示CUMS 抑郁刺激因子可誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的增加。有氧運(yùn)動能夠通過調(diào)控Bcl-2-Caspase-3/PARP 信號通路上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)，下調(diào)Caspase-3 及其下游信號分子PARP的表達(dá)，表明系統(tǒng)持續(xù)的規(guī)律運(yùn)動可能是抗抑郁海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡藥物開發(fā)的潛在手段。

4 結(jié) 論

本實驗通過神經(jīng)行為學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)檢測手段和方法，證實了有氧運(yùn)動可通過上調(diào)海馬組織抗凋亡因子Bcl-2 和膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3 及其底物PARP 的表達(dá)，發(fā)揮抗抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，改善小鼠神經(jīng)行為學(xué)功能，其作用可能通過Bcl-2-caspase-3/PRAP 信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。該成果可為有氧運(yùn)動成為運(yùn)動治療抑郁癥的輔助手段提供機(jī)制上的實驗證據(jù)，并為進(jìn)一步通過多種途徑和技術(shù)方法深入探討有氧運(yùn)動拮抗抑郁海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制提供新的研究思路。