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        響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶法提取小米谷糠蛋白工藝

        2021-09-28 22:53:19曹闊吳興雨孫凱楊姚玥馬佳孫豐梅
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2021年18期

        曹闊 吳興雨 孫凱楊 姚玥 馬佳 孫豐梅

        摘要:采用酶法提取小米谷糠蛋白,對小米谷糠進行脫膠、脫脂處理,以提取率為考察指標,從5種蛋白酶中篩選最適酶制劑。采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化酶的添加量、作用時間、作用溫度、浸提pH值,得出對谷糠蛋白提取率的影響。結(jié)果表明,小米谷糠蛋白的最佳提取率對應(yīng)的工藝條件如下:添加0.7%堿性蛋白酶,調(diào)節(jié)pH值為9,于50 ℃提取1.8 h,提取率為72.29%。由此可見,用堿性蛋白酶提取谷糠蛋白是一種高效的方法。

        關(guān)鍵詞:小米谷糠蛋白;蛋白酶;提取率;響應(yīng)面分析法;酶制劑;單因素試驗

        中圖分類號: TS210.4? 文獻標志碼: A

        文章編號:1002-1302(2021)18-0169-05

        收稿日期:2020-11-12

        基金項目:河北省科技廳項目(編號:18227132D);河北省教育廳項目(編號:ZD2017205)。

        作者簡介:曹 闊(1994—),男,碩士研究生,研究方向為糧食副產(chǎn)物的加工與利用。E-mail:879077255@qq.com。

        通信作者:孫豐梅,博士,副教授,研究方向為食品副產(chǎn)物加工利用與食品安全檢測。E-mail:shiliu0616@163.com。

        谷子(Setaria italica)屬禾本科植物,別稱稷、粟、粱,為一年生草本,目前多種植于歐亞陸地的溫帶和熱帶地區(qū),我國的黃河中上游是其主要種植區(qū)。谷子在我國的種植歷史可以追溯到六七千年前,是我國重要的糧食作物[1-2]。谷子加工成小米的過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物稱為小米谷糠,小米谷糠富含多種維生素和微量元素,具有益氣健脾、養(yǎng)血安神、補腎健腦的功效,對虧氣血、脾腎功能弱的失眠患者能夠起到積極作用。常食用谷糠能夠提高人體免疫力,小米谷糠不僅可以健身防病,還能治療失眠,是一種理想的補品[3]。在我國,人們更習慣將小米谷糠添加至飼料中。谷子在我國的種植面積廣、產(chǎn)量大,所以產(chǎn)生的小米谷糠也非常多,而小米谷糠中的谷糠蛋白含量豐富[4]。此外,小米谷糠蛋白還有保健及抗癌的作用。許潔研究發(fā)現(xiàn),小米谷糠清蛋白能對肝功能起到一定的保護作用,且氨基酸含量比大豆蛋白高,有益于嬰兒生長[3]。單樹花通過對小米谷糠蛋白進行分離純化,得到了活性蛋白FMB,并證明其對腫瘤細胞的抑制作用,表明其具有開發(fā)利用的潛力[5-6]。

        用酶法提取蛋白質(zhì)的報道日漸增多,酶法具有條件溫和、操作簡單、得率高等優(yōu)點,能夠更好地保留蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。目前,常用的酶類有纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶等[7-9]。本試驗通過粉碎、脫脂和超聲等方式對小米谷糠進行前處理,利用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析[10],進而得出最優(yōu)的提取條件組合,以期為小米谷糠在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        小米谷糠,購自河北巡天農(nóng)業(yè)科技有限公司;酶活性為50 U/mg的酸性蛋白酶;酶活性為100 U/mg的中性蛋白酶;酶活性為200 U/mg的堿性蛋白酶;酶活性為120 U/mg的復合蛋白酶;酶活性為 500 U/mg 的木瓜蛋白酶;牛血清蛋白標準品;考馬斯亮藍G-250、石油醚、無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉,均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        79-1磁力加熱攪拌器,購自常州澳華儀器有限公司;JA-1003N電子分析天平,購自上海精密科學儀器有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋,購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;JYL-C50T九陽料理機,購自九陽股份有限公司;PHS-3C酸度計,購自上海佑科儀器儀表有限公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 提取工藝 對小米谷糠進行脫脂處理后,粉碎過篩,加入10倍體積的蒸餾水,于超聲中處理 30 min,加入酶,調(diào)節(jié)pH值后浸提,于100 ℃滅活酶,離心后收集上清液,測定清蛋白含量;收集離心后的沉淀物并加入0.1 mol/L NaCl,測定球蛋白含量;收集并測定球蛋白沉淀物,加入75%乙醇,測定醇溶性蛋白含量;收集并測定醇溶性蛋白沉淀物,調(diào)節(jié)pH值為11,用NaCl溶液溶解,測定谷蛋白含量,4種蛋白含量之和即為谷糠蛋白提取率[11]。

        1.3.2 小米谷糠蛋白質(zhì)含量及提取率的測定 小米谷糠中的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定[12],提取液中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定[13]。提取率的計算公式如下:

        提取率=上清液中蛋白質(zhì)含量原料中蛋白質(zhì)含量×100%。

        1.3.3 最佳酶的篩選 在各種蛋白酶的最適條件下提取小米谷糠蛋白(表1),篩選試驗用酶制劑[14]。

        1.3.4 單因素試驗 分別測定加酶量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、提取pH值(8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、提取溫度(40、45、50、55、60 ℃)4個因素對小米谷糠蛋白提取率的影響。

        1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 采用響應(yīng)面軟件進行試驗設(shè)計,以A(加酶量)、B(溫度)、C(pH值)、D(時間)為4個因素,根據(jù)單因素試驗的結(jié)果選取3個水平進行試驗設(shè)計,試驗設(shè)計方案見表2[15]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 考馬斯亮藍曲線的繪制

        以牛血清蛋白為標準品,進行考馬斯亮藍曲線的繪制,結(jié)果見圖1。

        2.2 酶的篩選結(jié)果分析

        由圖2可知,按提取率由高到低排序為堿性蛋白酶>復合蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶,其中堿性蛋白酶的提取率達70.9%,因此本試驗選擇堿性蛋白酶作為酶制劑。

        2.3 單因素試驗結(jié)果分析

        由圖3可知,隨著加酶量的增加,谷糠蛋白的提取率表現(xiàn)出先上升后趨于平緩的趨勢,當加酶量為0.6%時,谷糠蛋白的提取率較高,當加酶量大于0.6%時,谷糠蛋白的提取率無明顯變化??紤]到經(jīng)濟因素,選擇最適加酶量為0.6%。

        由圖4可知,隨著提取時間的延長,谷糠蛋白的提取率逐漸上升,當提取時間大于1.5 h,提取率趨于平緩,因此選擇最適提取時間為1.5 h。

        由圖5可知,pH值是影響酶活性的重要因素,適宜的pH值將促進酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合,使提取率升高,谷糠蛋白的提取率隨著pH值的升高而出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當pH值為9.0時,谷糠蛋白的提取率最高。

        由圖6可知,谷糠蛋白的提取率隨著提取溫度的升高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當提取溫度不斷增加時,蛋白質(zhì)分子獲得更多的熱能,加速了蛋白質(zhì)間的碰撞,使得提取率上升;當提取溫度大于 50 ℃ 時,會導致酶失活,因此提取率出現(xiàn)下降趨勢。

        2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

        響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果見表3,其方差分析見表4。由表4可知,回歸模型具有極顯著性(P<0.000 1),其失擬性為0.286 9,結(jié)果表現(xiàn)為不顯著,可見該模型建立合理,能夠更好地預(yù)測試驗結(jié)果。影響提取率的因素排序為加酶量>提取時間>pH值>提取溫度。通過響應(yīng)面軟件對米糠蛋白的提取率進行二次多項回歸擬合分析,得到關(guān)于谷糠蛋白提取率的方程:Y=71.38+3.91A+2.82B+0.18C+0.13D-0.37AB+0.18AC-0.23AD+0.73BC-0.18BD+0.11CD-5.45A2-3.79B2-5.21C2-3.15D2。

        用Box-Behnken軟件對試驗結(jié)果進行分析,得到響應(yīng)曲面圖和等高線圖。從堿性蛋白酶的4個提取因素(加酶量、提取時間、提取pH值、提取溫度)對小米谷糠蛋白提取率影響的等高線和響應(yīng)曲面可以看出,三維響應(yīng)曲面越陡,說明該條件對提取率的影響越明顯,二維等高線越扁平,說明該條件的交互作用越明顯。由圖7至圖9可以看出,4種條件對小米谷糠蛋白提取率的影響大小為加酶量>提取時間>pH值>提取溫度。

        3 討論

        根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計得到如下米糠蛋白提取率的最佳工藝條件:堿性蛋白酶用量為0.67%,提取時間為1.68 h,提取溫度為49.99 ℃,pH值為9.02,相應(yīng)的理論提取率為72.57%??紤]到實際操作,對最佳工藝條件進行修正后的加酶量為0.7%,提取時間為1.7 h,提取溫度為50 ℃,pH值為9.0,根據(jù)該條件進行3次平行試驗并取平均值,得到谷糠蛋白提取率為72.29%,與理論提取率72.57%間的誤差小于1,說明該試驗結(jié)果有效。

        4 結(jié)論

        本試驗結(jié)果表明,堿性蛋白酶是提取小米谷糠蛋白的最優(yōu)蛋白酶。采用超聲波輔助酶法提取小米谷糠中的蛋白質(zhì),并采用響應(yīng)面設(shè)計法,利用Design-Expert軟件研究加酶量、提取時間、提取pH值和提取溫度對提取率的影響。經(jīng)試驗得到最優(yōu)提取條件組合為加酶量為0.7%,提取時間為 1.7 h,提取溫度為50 ℃,pH值為9.0,實際提取率為72.29%。

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