李輝玲 董潔 張國儒 火順利 葉遠榮 杜珊珊 張建文

摘要：為建立和優(yōu)化色素辣椒的InDel標(biāo)記PCR反應(yīng)體系，篩選多態(tài)性良好且重復(fù)性高的引物，為InDel分子標(biāo)記在色素辣椒輔助育種、品種純度鑒定及遺傳多樣性分析等提供可靠的技術(shù)支持。采用正交試驗、單因素試驗方法，對影響擴增體系中的模板DNA用量、引物濃度、2×Taq PCR Mix添加量等參數(shù)進行3因素4水平的正交試驗比較分析，對循環(huán)數(shù)進行單因素試驗優(yōu)化分析。結(jié)果表明，對InDel-PCR體系擴增結(jié)果的影響程度中引物濃度最大，其次是模板DNA用量，而2×Taq PCR Mix添加量的影響不大。根據(jù)檢測結(jié)果，出于成本和模板DNA用量的考慮，確定最佳InDel-PCR反應(yīng)體系（10 μL）：模板DNA用量為35 ng、引物濃度為0.5 μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量為5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃變性60 s，35個循環(huán);72 ℃變性5 min;擴增產(chǎn)物在4 ℃保存。從240對InDel通用引物中最終篩選出14對適用于色素辣椒InDel-PCR候選引物。InDel標(biāo)記是基于PCR的分子技術(shù)，選擇適宜的引物及模板DNA濃度對擴增出清晰、穩(wěn)定的條帶很重要，優(yōu)化后的10 μL InDel-PCR反應(yīng)體系及擴增程序，成功篩選出14條多態(tài)性較高的InDel引物，為后續(xù)的色素辣椒分子標(biāo)記研究提供了可靠技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：色素辣椒;InDel-PCR;反應(yīng)體系;引物篩選;擴增產(chǎn)物;參數(shù)優(yōu)化

中圖分類號：S641.303?? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0072-05

收稿日期：2020-12-30

基金項目：巴州財政支持基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費（編號：202008、202104）。

作者簡介：李輝玲（1988—），女，甘肅蘭州人，碩士，助理研究員，主要從事特色作物的育種與栽培。E-mail：12354399@qq.com。

通信作者：張建文，碩士，副研究員，主要從事番茄、色素辣椒等作物的育種與栽培。E-mail：1220743143@qq.com。

辣椒（Cicer arietinum L.）為全球第三大作物，年產(chǎn)量約60億kg[1]。近4年，我國辣椒平均年種植面積占世界辣椒總種植面積的35%，平均年產(chǎn)量占總產(chǎn)量的46%左右[2];辣椒產(chǎn)業(yè)已然躍升為我國最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)[3-4]。近年來許多領(lǐng)域限制人工色素的使用，天然色素需求量呈現(xiàn)逐年增長趨勢，據(jù)報道近年來辣椒紅素的市場銷售額年增長率一直保持在10%以上[4]。新疆色素辣椒在20世紀90年代開始在南北疆大范圍、規(guī)?；N植，主要有線椒、板椒、牛角椒、羊角椒等品種。與其他辣椒產(chǎn)地相比，新疆具有光照充足且溫差大的自然條件、機械化種植程度高、設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展快速[5]等現(xiàn)實優(yōu)點，這些都為色素辣椒的規(guī)模化生產(chǎn)提供了有利的先決條件，使其生產(chǎn)出的色素辣椒紅色素含量和產(chǎn)量高、病蟲害少而被國際市場青睞，成為新疆“紅色產(chǎn)業(yè)”重要組成之一[6]。

InDel標(biāo)記（insertion deletion length polymorphism）通過對比同一物種不同個體或近緣種間的DNA序列，根據(jù)同一位點上插入或缺失（insertion-deletion）的核苷酸片段設(shè)計引物并用PCR檢測其多態(tài)性[7]。InDel標(biāo)記具有共顯性、特異性、可重復(fù)性、準確性和穩(wěn)定性好且操作簡單等優(yōu)點[8]，在動植物群體遺傳分析、輔助育種等研究中得到了廣泛運用[9-10]。目前為止，對InDel標(biāo)記在色素辣椒PCR反應(yīng)體系、擴增程序和引物篩選等方面進行綜合性研究的報道很少。鑒于此，本試驗通過正交及單因素試驗，對反應(yīng)體系中的引物濃度、模板DNA用量、2×Taq PCR Mix添加量、循環(huán)數(shù)、退火溫度（Tm）等進行優(yōu)化，旨在建立一套適用于色素辣椒InDel標(biāo)記的最優(yōu)反應(yīng)體系，并從InDel分子標(biāo)記通用引物中篩選有效引物，為色素辣椒品種鑒定、親緣關(guān)系分析等分子標(biāo)記輔助育種提供可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

8份色素辣椒種子均由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物室提供，分別為B58、7-UC、MY、A27、FGH、HJZ、E8、B13（編號為1～8），于2020年10月在人工氣候室播種育苗，每份材料育苗40株。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 每個材料隨機取至少10株幼苗的嫩葉于密封袋中，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取時用組織研磨儀鋼珠高頻振蕩破碎法進行破碎研磨后參照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒（目錄號：DP320）的說明提取8份色素辣椒的DNA。具體試驗步驟：液氮預(yù)冷研磨儀配套的離心管盒、離心管和鋼珠等，稱取0.4 g葉片置于離心管內(nèi)，放置2個鋼珠后蓋好蓋子，振蕩破碎頻率設(shè)置為1 800次/min，振蕩 2 min，結(jié)束后用磁鐵小心取出鋼珠，依照試劑盒說明書的提取步驟獲得葉片粉末基因組DNA。在 140 V 恒壓下，用1%瓊脂糖凝膠電泳15 min后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。另用基因槍吸取1 μL DNA在核酸測定儀（NanoDrop-1000）上測定其質(zhì)量及濃度，獲取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 參考文獻[11]及新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所測序結(jié)果，共設(shè)計240對引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 InDel-PCR擴增體系正交試驗 PCR擴增在PCR擴增儀（Bio-Rad PCR儀）上進行。試驗采用10 μL體系，引物濃度、DNA模板量和2×Taq PCR Mix按L16（43）正交試驗設(shè)計（表1），以CIDH303為引物，總計16次試驗。擴增程序為94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃冰箱保存擴增產(chǎn)物。

1.2.4 退火溫度和循環(huán)數(shù)優(yōu)化 由于引物數(shù)量較多且不同引物最適Tm不同，為提高效率且盡可能地考慮每對引物的Tm，可根據(jù)引物報告單上的退火溫度初步設(shè)定范圍。以CIDH303為引物，結(jié)合上述檢測最優(yōu)參數(shù)配比，對循環(huán)數(shù)進行單因素試驗優(yōu)化，設(shè)置梯度為25、35、40、45個循環(huán)。觀察電泳圖，選擇多態(tài)性好且條帶清晰的循環(huán)數(shù)。

1.2.5 電泳檢測 采用6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠來檢測各個擴增產(chǎn)物，用北京六一電泳儀廠的DYY-12型電泳儀，在200 V恒定電壓下電泳 80 min，結(jié)束后小心拆膠，用銀染法顯色直至條帶清晰，在醫(yī)用膠片觀察燈下用數(shù)碼相機拍照。參考尚小紅等的直觀分析法[12]對16個正交組合的電泳圖譜中的條帶進行打分，打分依據(jù)：1～4分（清晰條帶少，雜帶多，重復(fù)性差，背景模糊），5～8分（清晰條帶多，有雜帶，重復(fù)性好，背景比較干凈），9～12分（清晰條帶多，無雜帶，重復(fù)性好，背景清晰），13～16分（清晰條帶多，亮度強，無雜帶，重復(fù)性好，背景清晰）。數(shù)據(jù)錄入Excel 2016，通過分析16個組合的均值（k）和極差（R），得出最佳因素配比和各因素影響程度的大小。

1.2.6 引物篩選 以8份辣椒材料為模板、利用優(yōu)化獲得的最佳InDel-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)數(shù)，對文獻[11]中提到的部分240條InDel引物進行篩選，篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性良好、差異明顯的引物作為色素辣椒InDel-PCR候選引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測

如圖1所示，電泳圖譜中條帶整齊清晰、帶型一致、未見拖尾，樣品間濃度較為均勻。核酸檢測儀測定結(jié)果表明，所提DNA質(zhì)量測定值D260 nm/D280 nm為 1.85～2.00，濃度為81～193 ng/μL。

2.2 InDel-PCR擴增體系正交試驗的優(yōu)化

擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖2）表明，16個處理組合的PCR均有條帶顯示，然而擴增效果存在明顯差異。進行遺傳多樣性分析，要求擴增條帶數(shù)量豐富、清晰度高。R越大，說明該因素對擴增效果影響越大，k越大，說明該水平下的擴增效果越好。由表2可知，各因素影響程度表現(xiàn)為引物濃度>模板DNA用量>2×Taq PCR Mix添加量，引物濃度為0.50 μmol/L、模板DNA用量為35 ng、2×Taq PCR Mix添加量為5 μL組合效果最好。綜合考慮以第5組合為最佳組合，即10 μL體系：0.50 μmol/L 引物，35 ng模版DNA，5 μL 2×Taq PCR Mix。

2.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

由圖3可知，當(dāng)循環(huán)數(shù)為25個時，擴增結(jié)果譜帶模糊;當(dāng)循環(huán)數(shù)達到35、40、45個時擴增譜帶清晰易辨。綜合考慮擴增總時長和譜帶質(zhì)量，最佳的循環(huán)數(shù)為35個。

2.4 引物篩選

以8份色素辣椒的DNA基因為模板，從240對InDel通用引物中最終篩選出14對有效引物（圖4，表3）。

3 討論

運用InDel分子標(biāo)記技術(shù)分析不同作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性，分析結(jié)果的分辨率、可重復(fù)性和準確性都有很大程度的提高[13]，從而在根本上解決了育種過程中時有發(fā)生的引種混亂、整理資源費時費力、育種材料間遺傳背景相似性高、培育新品種艱難等問題[14]。采用正交設(shè)計能夠用最少的試驗次數(shù)來闡明各試驗因素在不同水平間的相互作用，揭示各因素對擴增結(jié)果的影響程度和規(guī)律，由此得出最適宜的優(yōu)化結(jié)果。

InDel分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、擴增條帶簡單穩(wěn)定等優(yōu)點，但擴增結(jié)果也受體系中各個因素、多水平的綜合影響。引物濃度過低時擴增反應(yīng)不完全，條帶數(shù)量少并且不夠清晰，無法進行有效擴增;濃度過高產(chǎn)生錯配， 且形成大量引物二聚體導(dǎo)致非特

異性擴增產(chǎn)物增加。DNA模板量濃度太低會造成沒有擴增產(chǎn)物、或者擴增條帶不完全不穩(wěn)定;模板量濃度過高又會增加反應(yīng)體系中抑制反應(yīng)的成分，出現(xiàn)非特異性擴增條帶[15]。而擴增產(chǎn)量的多少很大程度上由循環(huán)次數(shù)決定。循環(huán)次數(shù)太少，擴增產(chǎn)物相應(yīng)的減少不足以滿足電泳需要，條帶不清晰;循環(huán)次數(shù)過多，當(dāng)反應(yīng)物消耗完就會進行非特異性擴增。綜合考慮擴增時間和帶型質(zhì)量，應(yīng)選擇較少的循環(huán)次數(shù)[16-17]。

本試驗最終確定色素辣椒Indel-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系（10 μL）：模板DNA用量為35 ng、引物濃度為0.5 μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量為5.0 μL，其余用 ddH2O補足。最佳擴增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，不同引物的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。以上述最佳反應(yīng)體系和擴增程序為基礎(chǔ)， 進一步在240對通用引物中篩選出高多態(tài)性、重復(fù)性良好的14對InDel有效引物，為色素辣椒的品種鑒定、遺傳多樣性等分子輔助研究提供了理論和技術(shù)支持。

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