苗衛(wèi)東 高換超 李俊濤 王宇揚(yáng) 李凱薇

摘要：月季花大而香，是名貴的觀賞植物，但采用常規(guī)的扦插和嫁接繁殖方法進(jìn)行繁殖成活率不高。采用霍爾恩月季一年生枝條為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)以擴(kuò)大繁殖系數(shù)，試驗(yàn)首先以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)月季萌芽率及生長(zhǎng)情況的影響，然后用獲得的月季無(wú)菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時(shí)間等多種因素對(duì)霍爾恩月季葉片不定芽誘導(dǎo)再生的影響。結(jié)果表明，月季腋芽萌發(fā)較適合的培養(yǎng)基為WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉;繼代培養(yǎng)較適合的培養(yǎng)基為WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉;TDZ對(duì)葉片不定芽再生有誘導(dǎo)作用。最適的培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂粉，暗培養(yǎng)時(shí)間為7 d，葉片的不定芽最高誘導(dǎo)率為9.70%。

關(guān)鍵詞：霍爾恩月季;無(wú)菌苗;葉片;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;不定芽

中圖分類(lèi)號(hào)：S685.120.4+3 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0048-06

收稿日期：2021-05-16

作者簡(jiǎn)介：苗衛(wèi)東（1968—），男，河南遂平人，副教授，主要從事園藝植物資源評(píng)價(jià)與利用研究。E-mail：ligrapes@hist.edu.cn。

月季被譽(yù)為“花中皇后”，是世界上最重要的觀賞植物之一，以其花朵美麗、四季常開(kāi)、花色豐富和香色濃郁，一直被大眾所喜歡，并且它還有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是城市綠化的主要材料。月季的自然花期為5月至11月，花大型，有香氣，廣泛用于園藝栽培和切花生產(chǎn)。中國(guó)是月季的原產(chǎn)地之一。中國(guó)有52個(gè)城市把它作為市花?；魻柖髟录臼秦S花月季的一個(gè)品種，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)健、分枝旺盛、株形優(yōu)美、主干及側(cè)分支不明顯，為灌叢生長(zhǎng)，其葉片刺體與雜種茶香月季相比略小，植株偏矮，通常在 30～70 cm?；魻柖髟录净ǘ漕伾噬蠲导t色，重瓣，花朵直徑4 cm，香氣宜人，霍爾恩月季花期不斷，群體栽植觀賞性較高。現(xiàn)代月季品種有35 000多個(gè)[1]，月季傳統(tǒng)的繁育方法如扦插、嫁接等具有一定的局限性，繁殖速度慢、種苗容易退化，對(duì)月季進(jìn)行離體培養(yǎng)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)苗，而且可以周年進(jìn)行生產(chǎn)。目前，對(duì)月季組培的研究主要集中在離體快繁方面[2]，關(guān)于植株再生體系的建立報(bào)道較少，建立高效的月季再生體系是開(kāi)展月季基因工程育種的前提。有關(guān)建立月季再生體系有2條途徑，即器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚途徑。本試驗(yàn)采用離體快繁的方法獲得大量的月季無(wú)菌材料，用其無(wú)菌材料的葉片作為外植體，通過(guò)器官發(fā)生途徑建立了月季不定芽再生的體系，為月季的轉(zhuǎn)基因奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020年2—6月開(kāi)展，材料采自河南新鄉(xiāng)河南科技學(xué)院月季種質(zhì)資源圃，采摘的月季品種為霍爾恩。于10：00左右選擇生長(zhǎng)健壯的植株取1年生長(zhǎng)勢(shì)好、無(wú)病蟲(chóng)害、芽體飽滿(mǎn)的月季中部枝條。誘導(dǎo)不定芽再生的材料是在河南科技學(xué)院園藝植物組培實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)35 d的無(wú)菌苗，取其葉片。

1.2 方法

1.2.1 月季腋芽初代培養(yǎng) 取1年生長(zhǎng)勢(shì)好、無(wú)病蟲(chóng)害、芽體飽滿(mǎn)的月季中部枝條。從大田取回后，除去葉片與莖刺，然后在流水下沖洗10 min洗去灰塵，然后加入適量洗潔精沖洗2 h后剪成帶1個(gè)芽體的莖段。在超凈工作臺(tái)上用0.1%氯化汞消毒 8 min，然后使用無(wú)菌水沖洗4次，每次沖洗5 min并不斷搖晃徹底沖洗殘留的氯化汞，用無(wú)菌濾紙把接種材料上的水吸干，把處理好的材料接種于以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的BA和NAA組合的9種初代培養(yǎng)基上，設(shè)置的培養(yǎng)基分別為：（1）C1：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（2）C2：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（3）C3：WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（4）C4：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（5）C5：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（6）C6：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（7）C7：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L;（8）C8：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（9）C9：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L。蔗糖20 g/L，瓊脂粉 6 g/L，pH值5.8[3-4]。每種培養(yǎng)基接種15瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，重復(fù)3次，共45瓶，接種好外植體后放在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx。

1.2.2 月季腋芽繼代培養(yǎng) 培養(yǎng)14 d后，由于初代培養(yǎng)時(shí)材料帶莖段容易污染，所以把初代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的腋芽剪下，進(jìn)行轉(zhuǎn)接至以WPM為基本培養(yǎng)基、添加不同濃度BA和NAA組合的9種繼代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分別（1）J1：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（2）J2：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（3）J3：WPM+BA 1.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L;（4）J4：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（5）J5：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（6）J6：WPM+BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L;（7）J7：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L;（8）J8：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L;（9）J9：WPM+BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L。蔗糖20 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH值5.8。在培養(yǎng)過(guò)程中一旦發(fā)現(xiàn)污染要及時(shí)處理，在培養(yǎng)過(guò)程中要不斷觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2.3 月季無(wú)菌苗葉片愈傷組織的誘導(dǎo) 選擇生長(zhǎng)勢(shì)良好，無(wú)污染的繼代培養(yǎng)35 d的無(wú)菌苗，將無(wú)菌苗葉片剪成適當(dāng)大小，在葉脈中部橫切幾下進(jìn)行刻傷，葉背向下分散接種到以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度2，4-D的5種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基分別為（1）Y1：MS+2，4-D0.0 mg/L;（2）Y2：MS+2，4-D1.0 mg/L;（3）Y3：MS+2，4-D 2.0 mg/L;（4）Y4：MS+2，4-D 4.0 mg/L;（5）Y5：MS+2，4-D 8.0 mg/L。蔗糖為20 g/L，瓊脂粉為 6 g/L，pH值為5.8。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接3個(gè)外植體，重復(fù)3次，共30瓶，培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，14 h光照。接種25 d后觀察愈傷組織的狀態(tài)變化，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.4 月季無(wú)菌苗不定芽的誘導(dǎo) 將培養(yǎng)30 d生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至以MS為基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ與NAA不同濃度組合10種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分別為：（1）B1：MS+NAA 0.1 mg/L;（2）B2：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（3）B3：MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（4）B4：MS+TDZ 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（5）B5：MS+TDZ 8.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;（6）B6：MS+NAA 0.2 mg/L;（7）B7：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（8）B8：MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（9）B9：MS+TDZ 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;（10）B10：MS+TDZ 8.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;對(duì)照CK：MS0。蔗糖為20 g/L，瓊脂粉為6 g/L，pH值為5.8。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接20塊愈傷組織，每個(gè)組合分別暗培養(yǎng)0、7、14、21 d，重復(fù)3次，共30瓶。然后放置在培養(yǎng)溫度為（24±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，14 h光照下培養(yǎng)，及時(shí)觀察不定芽誘導(dǎo)情況并在培養(yǎng)31 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出不定芽的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)月季腋芽萌發(fā)率的影響

通過(guò)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)莖段培養(yǎng)3 d后，腋芽開(kāi)始萌動(dòng)膨大0.2～0.3 cm，培養(yǎng)7 d后芽體高達(dá)0.9～1.0 cm，初代培養(yǎng)14 d后芽體長(zhǎng)度達(dá)1.6～1.7 cm，此時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)萌發(fā)個(gè)數(shù)，然后把生長(zhǎng)良好的芽體切下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上。

從表1可以看出，這9種組合都能使莖段腋芽萌發(fā)，培養(yǎng)基C4較適合腋芽萌發(fā)，萌發(fā)率為86.0%，長(zhǎng)勢(shì)好（圖1-A）。C7培養(yǎng)基腋芽萌發(fā)率最低，萌發(fā)率為40.0%，長(zhǎng)勢(shì)慢（圖1-B）。培養(yǎng)基C1、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9與培養(yǎng)基C4差異顯著，培養(yǎng)基C1、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9之間差異不顯著。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)月季繼代培養(yǎng)的影響

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腋芽莖段在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后把其切下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上7 d，生長(zhǎng)良好，葉片開(kāi)始展開(kāi)（圖2-A）。在J5培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后植株高度達(dá)2.5～2.7 cm（圖2-B），培養(yǎng) 35 d 后植株高度達(dá)4.2～4.7 cm （圖2-C）。

從表2可以看出，培養(yǎng)基J5較適合月季繼代生長(zhǎng)，培養(yǎng)基J5與培養(yǎng)基J9之間差異不顯著，都適合其生長(zhǎng)，但是J9培養(yǎng)基最初植株生長(zhǎng)較快，但是在繼代培養(yǎng)了25 d后葉片開(kāi)始變黃，植株質(zhì)量較差，所以只有培養(yǎng)基J5最適合月季繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基J1最不適合月季的繼代培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)月季無(wú)菌苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3可以看出，培養(yǎng)基中不加2，4-D時(shí)無(wú)法誘導(dǎo)出愈傷組織，最適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為Y3，誘導(dǎo)率最高，為83.0%。培養(yǎng)基Y4，誘導(dǎo)率為75.0%， Y3與Y4之間差異不顯著， 說(shuō)明這2種培養(yǎng)基都較適合月季愈傷組織的誘導(dǎo)。Y3、Y4與組合Y1、Y2、Y5之間差異顯著，其中Y3、Y4與Y2之間差異顯著性較小;與Y5之間差異顯著性較大;與Y1差異顯著性最大。

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的2，4-D對(duì)愈傷組織發(fā)生的時(shí)間、愈傷組織生長(zhǎng)質(zhì)量有很大影響。從圖3可以看出，當(dāng)不加2，4-D時(shí)不能產(chǎn)生愈傷組織，材料培養(yǎng)40 d后全部變褐死亡（圖3-A）;當(dāng)加1 mg/L 2，4-D，葉塊在培養(yǎng)25 d后在靠近切口卷曲處長(zhǎng)出少許的淡綠色愈傷組織，在后期的觀察中愈傷組織膨大生長(zhǎng)緩慢，愈傷組織質(zhì)地緊密（圖3-B）;當(dāng)加入2 mg/L 2，4-D，在培養(yǎng)10 d后葉柄切口長(zhǎng)出少許的綠色愈傷組織，葉塊開(kāi)始卷曲上翹長(zhǎng)出少量愈傷組織，15 d后愈傷組織繼續(xù)膨大，25 d后葉塊幾乎長(zhǎng)出全部鮮綠色愈傷組織（圖3-C）;當(dāng)加4 mg/L 2，4-D，在培養(yǎng)初期愈傷組織長(zhǎng)得很快，但生長(zhǎng)約25 d后長(zhǎng)出的綠色愈傷組織開(kāi)始變黃綠色（圖3-D）;當(dāng)加入8 mg/L 2，4-D，在生長(zhǎng) 15 d 時(shí)葉塊切口處開(kāi)始膨大，但是有很多材料開(kāi)始變褐，后期長(zhǎng)出的少許愈傷組織不再繼續(xù)膨大，最后幾乎全部變褐死亡（圖3-E）。

2.4 暗培養(yǎng)天數(shù)和不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)率的影響

從表4可以看出，霍爾恩月季誘導(dǎo)不定芽最適的培養(yǎng)基為B8（MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L），誘導(dǎo)率最高，B1與B6誘導(dǎo)率最低，說(shuō)明TDZ在月季不定芽誘導(dǎo)中起決定性作用，不添加TDZ無(wú)法誘導(dǎo)出不定芽。B8和其他9個(gè)組合差異顯著，B8和B3差異顯著性較小，說(shuō)明NAA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)率影響不大;B8和B7差異顯著，說(shuō)明TDZ濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)有很大影響;B8和其他7個(gè)組合差異顯著。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，月季無(wú)菌苗葉片主要在主脈切口處產(chǎn)生愈傷組織，月季不定芽誘導(dǎo)率很低，最高誘導(dǎo)率僅為9.70%，由圖4可以看出，在B8培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d后有芽將要長(zhǎng)出，30 d后長(zhǎng)出少許的不定芽。

3 討論與結(jié)論

3.1 TDZ對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

TDZ是一種新型的細(xì)胞分裂素類(lèi)似物，它不但具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，而且還具有生長(zhǎng)素的功能，在基本培養(yǎng)基MS上只加TDZ就能誘導(dǎo)赤霞珠葉片離體再生[5]。TDZ對(duì)薔薇科植物誘導(dǎo)不定芽有促進(jìn)效果[6]。相關(guān)報(bào)道表明，TDZ對(duì)體胚發(fā)生的作用因植物種類(lèi)而異，它對(duì)體胚發(fā)生的促進(jìn)作用與使用濃度和處理時(shí)間有關(guān)[7]。眾多研究指出，TDZ通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源植物生長(zhǎng)激素起作用。TDZ的誘導(dǎo)能力雖然很強(qiáng)，但是它也有一定的缺陷[8]。有研究指出，高濃度的TDZ能誘導(dǎo)愈傷組織形成和體胚的誘導(dǎo)，但抑制芽的生長(zhǎng)不利于伸長(zhǎng)，再生芽數(shù)也減少。高麗萍等在建立月季再生體系的研究中，分別采用直接及間接的誘導(dǎo)途徑，建立了薩曼莎月季的再生體系[9]。生長(zhǎng)素促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素配合一定的生長(zhǎng)素可共同促進(jìn)月季側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ對(duì)不定芽誘導(dǎo)有明顯影響，低濃度有利于不定芽的誘導(dǎo)。霍爾恩月季愈傷組織在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后轉(zhuǎn)到MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L分化培養(yǎng)基上，得到不定芽，證明TDZ對(duì)不定芽誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。

3.2 材料繼代時(shí)間對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，繼代35 d左右的植株較適合誘導(dǎo)出愈傷組織，繼代時(shí)間超過(guò)50 d，幾乎無(wú)法誘導(dǎo)出愈傷組織，長(zhǎng)出的少許愈傷組織變褐嚴(yán)重，無(wú)法誘導(dǎo)出不定芽。說(shuō)明葉片的幼嫩程度對(duì)其有一定的影響。參考相關(guān)資料取繼代35d的植株小葉，愈傷組織誘導(dǎo)率較高[10]。同時(shí)有研究指出，隨著愈傷組織繼代次數(shù)的增加，愈傷組織分化的能力也不斷下降，當(dāng)繼代次數(shù)超過(guò)5次，大部分的愈傷組織就幾乎沒(méi)有增殖的能力[11]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)愈傷組織不能進(jìn)行多次繼代，即使此試驗(yàn)繼代次數(shù)較少，其分化情況依然不理想。

3.3 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

在植物離體再生研究中，暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)再生效率有著非常重要的作用。暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短不能誘導(dǎo)再生出不定芽，過(guò)長(zhǎng)植物材料幾乎變褐死亡。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不進(jìn)行暗培養(yǎng)不能產(chǎn)生不定芽，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)暗培養(yǎng)時(shí)間為7 d時(shí)鮮綠色的愈傷組織開(kāi)始轉(zhuǎn)為淡綠色，質(zhì)地開(kāi)始變得稍疏松;當(dāng)暗培養(yǎng)時(shí)間為14 d時(shí)愈傷組織過(guò)于結(jié)實(shí)，開(kāi)始變黃褐色，愈傷組織膨大緩慢，暗培養(yǎng)21 d長(zhǎng)出的愈傷組織不再膨大，開(kāi)始變黃變褐死亡。所以在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中采用7 d暗培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同月季初代培養(yǎng)）。月季的再生培養(yǎng)中不同TDZ和NAA的濃度組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)有一定影響。在誘導(dǎo)不定芽階段，暗培養(yǎng)時(shí)間起著決定性的作用。有研究表明，適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)時(shí)間能促進(jìn)月季植株再生[12-13]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)有助于不定芽的誘導(dǎo)，霍爾恩月季不定芽誘導(dǎo)暗培養(yǎng)的最佳時(shí)間是7 d，不定芽在產(chǎn)生愈傷組織的切口處產(chǎn)生，相關(guān)研究指出，暗培養(yǎng)15 d以上不定芽的再生率可達(dá)到95.0%以上，植株的再生率達(dá)到60.0%以上[14]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到14 d時(shí)愈傷組織幾乎全變褐，無(wú)法誘導(dǎo)出不定芽。

3.4 碳源濃度對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

碳源的種類(lèi)對(duì)植株再生有很大的影響，它除為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能源外，在培養(yǎng)基中還起著維持一定滲透壓的作用，果糖和乳糖抑制植株再生，蔗糖和葡萄糖能提高不定芽的誘導(dǎo)率使植株獲得較高的轉(zhuǎn)化效率[15]。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度的蔗糖更有利于月季無(wú)菌體系的建立與不定芽的再生。

3.5 NAA對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

相關(guān)研究指出，不同濃度的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素組合使用，植株再生效果有很大差異[16]。有研究表明TDZ與NAA組合使用時(shí)，薔薇植物的再生率較高。月季愈傷組織在NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)分化出不定芽緩慢而且質(zhì)量差;NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，在愈傷組織中誘導(dǎo)出不定芽的時(shí)間短、質(zhì)量好，但是也發(fā)現(xiàn)在此濃度時(shí)愈傷組織有時(shí)無(wú)法誘導(dǎo)出不定芽而會(huì)誘導(dǎo)出多條根，說(shuō)明生長(zhǎng)素濃度高時(shí)有利于生長(zhǎng)出根，但是卻無(wú)法在不定芽上誘導(dǎo)出根，所以對(duì)于建立霍爾恩月季不定芽再生體系還要進(jìn)一步研究。

3.6 褐化現(xiàn)象對(duì)月季不定芽誘導(dǎo)的影響

相關(guān)研究認(rèn)為，植株必須具有80%以上的再生頻率，每個(gè)植物材料都能誘導(dǎo)出叢生芽，只有這樣才具有能成功轉(zhuǎn)化的可能[17]。雖然本試驗(yàn)做了很多對(duì)比研究，但是不定芽誘導(dǎo)率還是很低，原因主要是月季葉片在誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中容易褐化無(wú)法得到不定芽，得到的少數(shù)不定芽無(wú)法生根長(zhǎng)成完整植株，相關(guān)研究指出，在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化現(xiàn)象的發(fā)生也會(huì)影響根的生成[18]。所以，在今后的工作中應(yīng)該考慮如何控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，提高植株不定芽誘導(dǎo)率并使其長(zhǎng)成完整植株。

本試驗(yàn)中選用月季無(wú)菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，采用離體快繁技術(shù)研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時(shí)間等多種因素對(duì)霍爾恩月季葉片不定芽誘導(dǎo)再生的影響。研究得出最適的培養(yǎng)基為MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+20 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂粉，暗培養(yǎng)時(shí)間為7 d，葉片的不定芽最高誘導(dǎo)率為9.70%。

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