莊嚴(yán)，王少佩，王永林，胡玉龍，仝艷，董春紅，李曉飛

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）在中醫(yī)學(xué)中稱為“痹證”，是由于人體自身正氣不足受到外邪后，氣、血、津液、經(jīng)絡(luò)凝滯不通而導(dǎo)致的［1－10］。盡管現(xiàn)有藥物對(duì)RA的療效確切，但不良反應(yīng)明顯［11］。因此，探尋有效且不良反應(yīng)小的中藥方劑具有重要意義?！稘?jì)世養(yǎng)生集》卷三中記載豨桐丸具有“祛風(fēng)勝濕、舒筋活絡(luò)之功效。主治感受風(fēng)濕、兩足酸軟、步履艱難、狀似風(fēng)癱”。該方由臭梧桐葉及豨薟草等量調(diào)劑而組成。《新修本草》中記載“豨薟草，辛、苦、寒，有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、解毒之功效”；《本草圖經(jīng)》中記載“臭梧桐葉，藥性辛、苦、甘、涼，歸肝經(jīng)，祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、平肝”?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用中，豨薟草常被應(yīng)用于治療風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)半身不遂、四肢麻木、腰膝酸軟［12］等；臭梧桐葉被應(yīng)用于治療風(fēng)濕痹癥［13］，兩者相須為用，臨床主要用于治療風(fēng)濕、RA及其相關(guān)病癥，尚未有不良反應(yīng)的報(bào)道。研究表明，豨桐丸通過(guò)抑制炎性介質(zhì)來(lái)治療RA［14］，但無(wú)分子水平上的治療機(jī)制研究。本研究運(yùn)用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究豨桐丸活性成分與RA相關(guān)靶蛋白的結(jié)合模式和結(jié)合能，探究豨桐丸治療RA的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)單成分－多靶點(diǎn)、多成分－單靶點(diǎn)、單成分－單靶點(diǎn)的作用分析，探討了豨桐丸活性成分與RA相關(guān)靶蛋白的作用機(jī)制，從豨桐丸的活性成分中篩選出可能用于治療RA的關(guān)鍵成分，為進(jìn)一步的藥物設(shè)計(jì)與研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豨桐丸活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立臭梧桐葉的提取物含有多種化學(xué)成分。王昭［15］把臭梧桐葉的化學(xué)成分分為六類(lèi)：揮發(fā)油類(lèi)，共5種，分別為1－己醇、伽羅木醇、2，6，10，15－四甲基十七烷、5－甲基－3－庚酮和2，6，6－三甲基環(huán)己酮；黃酮類(lèi)，共8種，分別為芹菜素、芹菜素－7－葡萄糖醛酸、車(chē)前草苷、臭梧桐素、海常素、海州常山苷、刺槐素－7－二葡萄糖醛和金合歡素－7－二葡萄糖醛酸；還有苯丙素類(lèi)、生物堿類(lèi)、糖苷類(lèi)和其他類(lèi)。宋婷［13］、Kim KM等［16］發(fā)現(xiàn)，豨桐丸中含有的苯丙素類(lèi)化合物有異青角甾苷、毛蕊花糖苷和去咖啡酰毛蕊花糖苷，還發(fā)現(xiàn)了其他苯丙素類(lèi)化合物咖啡酸甲酯、去鼠李糖洋丁香酚苷、去鼠李糖異洋丁香酚苷、3，4－二羥基苯乙醇［17］、1－O－咖啡苷、洋丁香酚苷、異洋丁香酚苷、地黃苷和異地黃苷［18］；生物堿類(lèi)化合物有常山堿、常山定堿和異常山定堿［19］。胡海軍等［20］采用石油醚對(duì)臭梧桐葉進(jìn)行萃取得到了羽扇豆醇、木栓酮、白樺脂酸、蒲公英賽酮、赪桐甾酮等有機(jī)物質(zhì)。徐瑞蘭等［21］從臭梧桐葉提取分離了11種化學(xué)成分：β－谷甾醇、β－胡蘿卜苷、芹菜素、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯、乙酸橙酰胺、類(lèi)葉升麻苷、馬替諾皂苷、5－羥甲基糖醛、corchorifalty酸E、單棕櫚酸甘油和正葵醇。結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)［22］（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）及文獻(xiàn)報(bào)道，最終歸納得到了豨薟草共31種化學(xué)成分。

參考擴(kuò)大范圍的類(lèi)藥五原則，以相對(duì)分子質(zhì)量＜700，氫鍵給體數(shù)＜5，氫鍵受體數(shù)目＜10，酯水分配系數(shù)＜5，以及口服生物利用度（oral bioarailability，OB）≥20%和類(lèi)藥性（drug－likeness，DL）＞0.10作為篩選依據(jù)，分別從臭梧桐葉和豨薟草成分中篩選（并刪重）得到39個(gè)化合物（表1）。采用Chem 3D軟件構(gòu)建所有小分子的三維結(jié)構(gòu)，采用MM2分子力學(xué)方法進(jìn)行幾何優(yōu)化，優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)即為分子對(duì)接的小分子初始構(gòu)象。

表1 豨桐丸的39種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

續(xù)表1 豨桐丸的39種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

1.2 靶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

研究表明，多種酶參與了RA的發(fā)生。非受體型酪氨酸激酶JAK1及JAK3可與炎癥因子白細(xì)胞介素結(jié)合，導(dǎo)致RA炎癥癥狀，因此選擇性抑制JAK1及JAK3的活性治療RA［23］；受體酪氨酸激酶Syk使下游的核因子－κB（neclear factor kappa B，NF－κB）活化，最終上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子－1（intercelular adhesion molecule－1，ICAM－1）導(dǎo)致RA的發(fā)生；Yeh等［24］研究表明，與RA炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如AP－1、NF－κB及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子的活性直接或間接地受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，而MAPK激酶1（MEK1）能夠?qū)APK的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化，使之激活，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的信號(hào)整合到MAPK，從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的合成和促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，從而發(fā)生了RA。因此，本研究選擇p38 MAPK［25－26］、JAK1和JAK3［25］、Syk［26］、MEK1等5種酶建立RA靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，其3D結(jié)構(gòu)從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.rcsb.org／）下載（PDB ID分別為：1OUY、4K6Z、3ZC6、4PUZ、1S9J）。采用Autodocktools 1.5.6軟件［27］刪除晶體中多余的小分子、結(jié)晶水，為蛋白分子添加氫原子、gasteiger電荷。

1.3 分子對(duì)接

1.3.1 參數(shù)設(shè)置分子對(duì)接方法采用AutoDock 4.2程序［28］。構(gòu)象搜索采用拉馬克遺傳算法，群體規(guī)模：150；能量最大評(píng)估數(shù)：2 500 000；最大遺傳代數(shù)：27 000；獨(dú)立運(yùn)行次數(shù)：10次。其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。

1.3.2 方法可靠性驗(yàn)證為了驗(yàn)證autodock程序?qū)Ρ狙芯恐袑?duì)接體系的可靠性［29］，分別將5種靶蛋白復(fù)合物的原有配體抽離，再重新對(duì)接到復(fù)合物的活性口袋，并計(jì)算對(duì)接后配體的構(gòu)象與原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的均方根偏差值（root－mean－sguare deviation，RMSD）。一般認(rèn)為當(dāng)RMSD值≤2.0?時(shí)，證明該對(duì)接方法可以較好地重現(xiàn)配體受體原來(lái)的結(jié)合模式，對(duì)接參數(shù)設(shè)置合理［30］。

1.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬為了驗(yàn)證小分子與蛋白對(duì)接結(jié)果的合理性和穩(wěn)定性，參考Jacob D Durrant等［31］提出的模擬方法，對(duì)對(duì)接結(jié)合能低的化合物和相關(guān)靶蛋白的對(duì)接復(fù)合物進(jìn)行了進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬與分析。

分子動(dòng)力學(xué)采用Amber18進(jìn)行，大分子采用AMBER ff14SB力場(chǎng)，小分子采用GAFF力場(chǎng)［32］。在HF／6－31＋G（d）水平下，運(yùn)用Gaussian 09軟件對(duì)小分子進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，并添加resp電荷。溶劑模型選擇TIP3P，將蛋白置于立方體水盒子中，盒子邊緣與蛋白分子距離為10?，添加抗衡離子使體系保持電中性。經(jīng)過(guò)以下步驟使體系達(dá)到平衡：①限制蛋白分子，優(yōu)化溶劑分子。共4 000步，其中前2 000步應(yīng)用最陡下降法，后2 000步使用共軛梯度法優(yōu)化；②限制蛋白中重原子的位置的優(yōu)化。共5 000步，前2 500步采用最陡下降法，后2 500步采用共軛梯度法優(yōu)化；③不加約束力整體優(yōu)化。共10 000步，前5 000步應(yīng)用最陡下降法，后5 000步應(yīng)用共軛梯度法；④60 ps的升溫過(guò)程：0～50 ps內(nèi)將系統(tǒng)溫度從0 K逐漸升至310 K，50 ps～60 ps達(dá)到恒溫310 K；⑤50 ns動(dòng)力學(xué)模擬：采用NPT系統(tǒng)，時(shí)間步長(zhǎng)設(shè)為2 fs。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1 成分靶點(diǎn)篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）中以O(shè)B≥20%，DL＞0.10為條件，篩選出豨薟草的化學(xué)成分，同時(shí)搜集成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息；從Swisstargets數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）中檢索豨桐丸4個(gè)對(duì)接結(jié)合能最低的化合物7、11、19、21（見(jiàn)表1）對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息。合并刪重后，將兩部分靶點(diǎn)匯總。

1.5.2 疾病靶點(diǎn)篩選以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.genecards.org／）和NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene／term＝）進(jìn)行檢索。將Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的基因根據(jù)relevance值的中位數(shù)進(jìn)行2次基因篩選。

1.5.3 韋恩圖、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（protein－protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治龊Y選出的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入韋恩圖作圖軟件Venny 2.1，得到藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，并將其輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／string－db.org／cgi／input.pl）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；然后將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.6.0軟件中，通過(guò)NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯杂?jì)算度、介度、平均最短距離和緊密度4個(gè)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)度值排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白類(lèi)型。

1.5.4 中藥－成分－疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建藥物－成分－疾?。悬c(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。將1.5.1中篩選得到的靶點(diǎn)與中藥成分進(jìn)行映射關(guān)聯(lián)，得到“成分－靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)表，與PPI網(wǎng)絡(luò)共同導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建豨桐丸的“中藥－化合物－靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

1.5.5 MCODE聚類(lèi)分析通過(guò)MCODE分析進(jìn)行RA治療過(guò)程中關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，通過(guò)MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.5.6 GO富集分析將成分與疾病的共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，包括生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cell component，CC）富集。采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)P≤0.05進(jìn)行篩選，使用R 3.6.3軟件進(jìn)行柱狀圖繪制，選擇BP、MF、CC富集程度的前10條通路作圖。

1.5.7 KEGG通路富集將成分與疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)P值≤0.05進(jìn)行篩選，采用R 3.6.3軟件進(jìn)行氣泡圖的繪制。

2 結(jié)果

2.1 分子對(duì)接結(jié)果

2.1.1 方法可靠性驗(yàn)證與晶體結(jié)構(gòu)相比，對(duì)接后的5個(gè)復(fù)合物的RMSD值分別為：1.71、1.78、1.29、1.85、1.05á。5個(gè)靶蛋白原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象與對(duì)接后配體的構(gòu)象疊合，見(jiàn)圖1；5個(gè)對(duì)接后的配體構(gòu)象與原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象基本重合。疊合構(gòu)象和RMSD值均表明本分子對(duì)接方法和參數(shù)設(shè)置可靠。

圖1 5個(gè)靶點(diǎn)蛋白復(fù)合物1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）原始晶體結(jié)構(gòu)中配體的構(gòu)象與對(duì)接后配體的構(gòu)象疊合對(duì)比

2.1.2 豨桐丸化學(xué)成分與靶蛋白對(duì)接結(jié)果以晶體原有配位作為陽(yáng)性對(duì)照，將5個(gè)靶點(diǎn)蛋白與豨桐丸的39個(gè)成分進(jìn)行對(duì)接，配體與靶蛋白的打分結(jié)果（結(jié)合能ΔG），見(jiàn)圖2。

圖2 豨桐丸中39個(gè)化學(xué)成分與靶蛋白1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）的結(jié)合能

對(duì)豨桐丸中39個(gè)小分子與5個(gè)靶蛋白的結(jié)合能較低的前5個(gè)化合物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共有3、7、10、11、14、17、19、21、29、38、39等11個(gè)，頻率排序依次為7（5次）；11、19、21（4次）；38、39（3次）；10、14（2次）；3、17、29（1次）。因此，推測(cè)豨桐丸治療RA可能是通過(guò)以上化合物對(duì)相關(guān)蛋白的強(qiáng)抑制作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2.1.3 豆甾醇與5個(gè)靶蛋白的相互作用分析（單成分－多靶點(diǎn)作用）對(duì)接結(jié)果表明，化合物7（豆甾醇）與所有靶蛋白都有較低的結(jié)合能，顯示其具有單成分－多靶點(diǎn)的作用。為了進(jìn)一步分析豆甾醇和相關(guān)靶蛋白的作用機(jī)制，使用Ligplot軟件［33］對(duì)豆甾醇與各靶蛋白對(duì)接的復(fù)合物的配體－受體相互作用進(jìn)行分析，見(jiàn)圖3。

2.1.4 4個(gè)化合物與靶蛋白3ZC6作用的模式分析（多成分－單靶點(diǎn)作用）化合物7、11、19和21與靶蛋白3ZC6具有較負(fù)的結(jié)合能，能有效抑制相關(guān)靶點(diǎn)，存在多成分－單靶點(diǎn)的作用機(jī)制。將化合物7、11、19、21與靶蛋白3ZC6對(duì)接的復(fù)合物的配體－受體相互作用見(jiàn)圖3（B）和圖4。

圖3 化合物7與1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）的相互作用示意圖

圖4 靶蛋白3ZC6與化合物11（A）、化合物19（B）、化合物21（C）的相互作用示意圖

由2.1.3和2.1.4結(jié)果推測(cè)，當(dāng)配體與靶蛋白結(jié)合時(shí)，非極性相互作用能夠?qū)Π械鞍缀团潴w的結(jié)合產(chǎn)生促進(jìn)作用，即化合物與靶蛋白結(jié)合形成較多的疏水作用時(shí)，具有較低的結(jié)合能，結(jié)合更加穩(wěn)定，有效抑制靶蛋白的活性。因此，小分子與靶蛋白之間主要是通過(guò)疏水作用結(jié)合來(lái)抑制有關(guān)酶的活性，從而起到治療RA的作用。

2.1.5 豆甾醇與靶點(diǎn)結(jié)合的相互作用分析對(duì)接表明，豆甾醇和靶蛋白具有較強(qiáng)的相互作用和活性，豆甾醇由甾體骨架和一個(gè)羥基構(gòu)成，為了驗(yàn)證其羥基是否對(duì)活性起關(guān)鍵作用，將其羥基替換為疏水的甲基，再次進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，羥基換成甲基后的化合物與5個(gè)靶蛋白的結(jié)合能均有所降低，但下降的程度不明顯，表明豆甾醇與靶蛋白的主要結(jié)合力來(lái)自豆甾醇的碳骨架原子和相關(guān)氨基酸殘基的疏水作用，而羥基對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)較弱，并非關(guān)鍵活性基團(tuán)，這為后續(xù)該藥物的優(yōu)化和設(shè)計(jì)提供了改造思路。

表2 改造前后的豆甾醇與5個(gè)靶蛋白對(duì)接打分（ΔGbinding，kcal·mol－1）

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

2.2.1 分子疊合分析為了更直接的觀察豆甾醇與相關(guān)靶蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，選取豆甾醇與靶蛋白4PUZ的蛋白復(fù)合物，從0 ns開(kāi)始，每隔5 ns提取一次蛋白構(gòu)象，共提取10個(gè)構(gòu)象，與初始構(gòu)象進(jìn)行疊合，疊合結(jié)果見(jiàn)圖5。提示，小分子雖然有構(gòu)象位置的調(diào)整，但中心基本重合，表明二者結(jié)合穩(wěn)定。

圖5 豆甾醇與靶蛋白4PUZ的蛋白復(fù)合物構(gòu)象疊合

2.2.2 RMSD分析以對(duì)接結(jié)構(gòu)平衡后的構(gòu)象為參照，通過(guò)分析整體蛋白結(jié)構(gòu)的RMSD在模擬過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而考察復(fù)合物體系的穩(wěn)定性。5個(gè)靶蛋白的骨架原子和豆甾醇的非氫原子在50 ns內(nèi)的RMSD變化情況，見(jiàn)圖6。從圖6（B）、圖6（D）和圖6（E）可看出，小分子在平衡的最初期進(jìn)行了構(gòu)象的調(diào)整，之后達(dá)到了穩(wěn)定。圖6（A）和圖6（C）的小分子在25 ns和30 ns之間構(gòu)象進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整后趨于穩(wěn)定。復(fù)合物和大分子的RMSD基本穩(wěn)定。RMSD值表明豆甾醇和4個(gè)靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)對(duì)接結(jié)果合理可靠。

圖6 豆甾醇與靶蛋白1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）復(fù)合物分子動(dòng)力學(xué)軌跡的RMSD分析

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果與分析共得到化合物7、11、19、21對(duì)應(yīng)的237個(gè)靶點(diǎn)，豨薟草14個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的58個(gè)靶點(diǎn)，將兩部分靶點(diǎn)刪重匯合共得到284個(gè)成分靶點(diǎn)。

2.3.1 RA靶點(diǎn)查找經(jīng)過(guò)檢索，從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到1 067個(gè)相關(guān)基因，從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)共得到1 206個(gè)基因。將這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因合并刪重之后，得到與RA相關(guān)的基因共1 651個(gè)。

2.3.2 韋恩圖將篩選出的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)做出韋恩圖，得到112個(gè)交集靶點(diǎn)，作為豨桐丸治療RA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，如圖7（A）所示。

2.3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鯬PI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建見(jiàn)圖7（B），圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白間的關(guān)聯(lián)，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中占有的地位就越大。共篩選出42個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，將前20個(gè)靶點(diǎn)使用R 3.6.3繪制拓?fù)湫再|(zhì)如圖7（C）所示。結(jié)果表明，豨桐丸治療RA的過(guò)程中有白蛋白（ALB）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、SRC原癌基因（SRC）、半胱天冬酶（CASP3）、前列腺素G／H合成酶2（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9）等多種物質(zhì)。

2.3.4 中藥－成分－疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選得到的112個(gè)靶點(diǎn)與豨桐丸成分進(jìn)行映射關(guān)聯(lián)，得到13個(gè)化學(xué)成分的“成分－靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)表，與PPI互作表共同導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建豨桐丸的“中藥－化合物－靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，如圖7（D）所示（藍(lán)色：活性化合物；黃色：靶點(diǎn)；紫色：組方中藥；紅色：疾病即RA）。根據(jù)度值排序，值越大，成分越重要。其中，谷甾醇（beta－sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、羽扇豆醇（lupeol）、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯（apigenin－7－O－beta－D－glucuronide butyl ester）4種活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目分別為：47、46、40、40，遠(yuǎn)高于其它14種活性成分，表明這4種成分是豨桐丸治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分，該結(jié)果和分子對(duì)接結(jié)果完全一致。連接度前6的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因是PGR、PTGS2、PTGS1、SLC6A4、CYP19A1、DRD2，表明以上的基因可能是豨桐丸治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因。中藥－成分－疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析表明每個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)化合物相關(guān)聯(lián)，豨桐丸在發(fā)揮藥效時(shí)可同時(shí)影響多個(gè)關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新的RA藥物和臨床治療研究提供了新的方向。

圖7 豨桐丸“中藥－成分－疾?。悬c(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖構(gòu)建

2.3.5 MCODE聚類(lèi)分析通過(guò)MCODE分析進(jìn)行RA治療過(guò)程中關(guān)鍵基因的篩選，共得到2個(gè)基因簇和2個(gè)核心基因，核心基因?yàn)镸APK、PPARG（圖8）。

圖8 豨桐丸活性成分治療RA的MCODE聚類(lèi)分析

2.3.6 GO富集分析將治療藥物與疾病的共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共富集到2 058條生物過(guò)程，119項(xiàng)分子功能相關(guān)，55項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)。用R 3.6.3軟件進(jìn)行柱狀圖繪制，選擇BP、MF、CC富集程度的前10條通路作圖，如圖9。

GO富集分析（圖9）表明豨桐丸在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過(guò)程主要涉及脂多糖反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、類(lèi)固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、細(xì)菌起源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、對(duì)外部刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)（regulation of response to external stimulus）、骨髓細(xì)胞分化（myeloid cell differentiation）、節(jié)律過(guò)程（rhythmic process）、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）等生物過(guò)程。細(xì)胞組分主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane mirodomain）、膜區(qū)（membrane region）、突觸前膜的組成部分（integral component of presynaptic membrane）、突觸前膜的固有成分（intrinsic component of presynaptic membrane）、突觸膜的組成部分（integral component of synaptic membrane）、突觸前膜（presynaptic membrane）等。此外，主要涉及的分子功能有核受體活性（nuclear receptor activity）、類(lèi)固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、類(lèi)固醇結(jié)合（steroid binding）、絲氨酸肽酶活性（serinetype peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、血紅素結(jié)合（heme binding）等。

圖9 豨桐丸活性成分治療RA的GO富集分析

2.3.7 KEGG通路富集將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，富集到共133條信號(hào)通路。運(yùn)用R 3.6.3軟件進(jìn)行氣泡圖繪制，見(jiàn)圖10。豨桐丸在治療RA的過(guò)程中可能是通過(guò)神經(jīng)活性受體—配體相互作用（neuroactive ligand－receptor interaction）通路、癌癥蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、人巨細(xì)胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection）、糖尿病并發(fā)癥中的ACE－RAGE受體信號(hào)通路（ACE－RAGE signaling pathing in diabetic complications）、乙肝通路（hepatitis B）、皰疹病毒感染通路（kaposi sarcoma－assciated herpesvirus infection）等通路發(fā)揮作用。說(shuō)明豨桐丸主要活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的代謝通路中，多成分、多靶點(diǎn)的相互作用可能是豨桐丸發(fā)揮療效的作用機(jī)制。

圖10 豨桐丸活性成分治療RA的KEGG富集分析

3 討論

本研究運(yùn)用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)的研究方法篩選出了豨桐丸治療RA的活性成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法驗(yàn)證了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步闡明了豨桐丸治療RA的分子機(jī)制。兩者相輔相成，從多個(gè)方面證實(shí)豨桐丸是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用來(lái)發(fā)揮療效的。

根據(jù)分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“藥物－成分－疾?。悬c(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鼋Y(jié)果，本研究從理論上解釋了以上活性成分的可能的抗RA機(jī)制。通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)豨桐丸中對(duì)治療RA的相關(guān)酶有強(qiáng)抑制作用的活性物質(zhì)有豆甾醇（7）、羽扇豆醇（11）、谷甾醇（19）及芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯（21）和一定抑制作用的有白樺脂酸（3）、木栓酮（10）、異類(lèi)葉升麻苷（14）、臭梧桐素（17）等7種化學(xué)成分，提示上述成分可能是豨桐丸發(fā)揮藥效的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，且主要是通過(guò)疏水作用抑制靶蛋白活性發(fā)揮治療作用。研究表明，豆甾醇（7）不僅能夠抑制JAK信號(hào)通路，還能明顯抑制MMP9的表達(dá)，抑制PTGS2的釋放，同時(shí)抑制軟骨的降解，證明了豆甾醇具有治療骨關(guān)節(jié)炎的潛力［34］。谷甾醇（19）的抗炎機(jī)制是通過(guò)抑制NO的合成，降低白細(xì)胞介素－6（inter leukin－6，IL－6）活性，減少NF－κB遷移和炎癥因子的分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的［35］，且具有調(diào)節(jié)骨代謝平衡的藥理活性［36］；羽扇豆醇（11）可抑制人VEGFA表達(dá)，防止血管再生［37］，能夠調(diào)節(jié)炎癥通路（MAPK通路）中多蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗炎［38］。芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖酸醛苷丁酯（21）具有保護(hù)神經(jīng)組織和骨組織的功能，促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡和炎癥因子的分解［39］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，豨桐丸發(fā)揮治療的作用是而一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)PPI分析并構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，篩選到ALB、TNF、VEGFA、MAKP3、SRC、PTGS2等20個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白，這些蛋白共同參與調(diào)控RA的發(fā)展。其中，ALB作為炎癥反應(yīng)的先導(dǎo)產(chǎn)物，可以激活p38MAPK蛋白通過(guò)乙肝通路產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［40］；TNF－α作為促炎因子，誘導(dǎo)滑膜成纖維樣細(xì)胞釋放VEGFA，使成纖維細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增生，形成血管翳，造成骨關(guān)節(jié)的破壞［41］。此外，SRC，PTGS2的高表達(dá)也與RA密切相關(guān)［42－43］?；诖耍覀冋J(rèn)為豨桐丸可能是通過(guò)影響ALB、TNF、VEGFA、MAPK3、SCR、PTGS2等蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其治療RA的作用。其中，神經(jīng)活性配體受體相互作用通路是富集得到的關(guān)鍵通路，它是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的配體的集合［44］。由此可見(jiàn)，豨桐丸對(duì)RA的治療作用可能是通過(guò)活性成分調(diào)控基因MAPK的表達(dá)，影響MAKP調(diào)節(jié)著多種基因的表達(dá)［45］，控制蛋白的分泌，最終匯集在神經(jīng)活性配體受體相互作用通路等通路上起到治療的作用。

本研究能夠?yàn)樨g桐丸的推廣使用及治療RA藥物的設(shè)計(jì)與研發(fā)提供理論指導(dǎo)，但更深入的作用機(jī)制研究仍需進(jìn)一步的體外活性測(cè)試及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。