李艷華，薛曉鷗，李穎，劉君

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

卵巢儲備功能（ovarian reserve，OR）指女性卵巢內(nèi)儲存及募集原始卵泡的能力，代表女性生育力的強弱［1］。卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指由于卵巢內(nèi)可募集的有效卵泡數(shù)目減少，或者卵母細(xì)胞數(shù)量下降，引起月經(jīng)量減少、月經(jīng)稀發(fā)或者卵巢早衰，從而導(dǎo)致女性生育力下降［2］，主要以月經(jīng)改變、反復(fù)流產(chǎn)及不孕為臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量［3－4］。卵巢功能的降低對女性的生育力有無法逆轉(zhuǎn)的影響。近幾年DOR的發(fā)病率不斷增高［5］，具體發(fā)病機制尚不完全明確，目前普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，包括年齡、免疫、遺傳、心理、生活習(xí)慣等［6］。西醫(yī)尚無確切的治療方法，主要以去除病因、保存卵巢功能為主，并用激素替代療法建立人工周期，遠(yuǎn)期效果不甚理想，迫切需要尋找治療DOR的新方法［7－8］。

中醫(yī)古籍中未見“卵巢儲備功能減退”的記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸類為“不孕”“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”等范疇，主要病機為腎虛，兼有肝郁、血瘀、脾虛等，其中以腎虛肝郁型最為常見，治療方法多以補腎疏肝為主［9］。腎主生殖，為先天之本，腎中精氣滿盈，天癸至，月經(jīng)按時來潮，標(biāo)志著女性卵巢功能成熟。卵母細(xì)胞的發(fā)育及卵子排出靠腎氣的推動及腎精的滋養(yǎng)，若腎功能失常，則直接影響卵巢功能［10］。肝主疏泄，和情志，暢氣血，肝疏泄功能正常，則氣機順暢，氣血通調(diào)，經(jīng)血按時來潮。反之，肝疏泄失常，氣血失調(diào)，沖任失和，或郁久化火，或成瘀，日久則影響卵巢功能［11］。本團隊致力于研究補腎疏肝法聯(lián)合五行音樂治療女性卵巢儲備功能減退，發(fā)現(xiàn)臨床DOR患者多伴有不同程度的抑郁狀態(tài)［12－13］。為進一步研究肝郁對卵巢儲備功能的影響，本文建立肝郁型小鼠模型，采用補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂進行干預(yù)，探討肝郁型小鼠卵巢儲備功能的情況及補腎疏肝法聯(lián)合五行音樂對其的療效。

1 材料

1.1 動物健康清潔級性成熟的、有規(guī)律動情周期的雌性KM小鼠40只，7～9周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自山東省動物實驗中心，許可證號：SCXK（魯）20140007。

1.2 藥物與試劑補腎疏肝方（當(dāng)歸15 g，熟地黃15 g，白芍15 g，赤芍15 g，川芎10 g，黨參15 g，炒白術(shù)15 g，菟絲子15 g，女貞子15 g，續(xù)斷15 g，玫瑰花15 g，月季15 g，購自河南省中醫(yī)藥研究院中藥房）；逍遙散（當(dāng)歸30 g，白芍30 g，柴胡30 g，白術(shù)30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g，購自河南省中醫(yī)藥研究院中藥房）。促卵泡刺激素（lutropin alfa hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒、雌二醇（estradiol，E2）ELISA試劑盒（福建景天化學(xué)試劑公司，批號：20190431002、20190431003）；蘇木素染色液、伊紅染色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI－9710、ZLI－9713）。

1.3 儀器Amersham Imager 600型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司）；XSP顯微鏡（江南光電集團有限公司）；自制曠場箱：長和寬各60 cm，高40 cm，底部劃分25個等面積方格，內(nèi)面均用黑漆涂黑；H1650R型離心機（湖南湘儀儀器有限公司，離心半徑：18 cm）；EG1150H型包埋儀（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 藥物制備將補腎疏肝方中藥飲片浸泡、煎煮，將藥液混合并過濾、濃煎，加水定容至1.3 g·mL－1，獲得補腎疏肝方濃煎液，4℃保存?zhèn)溆?。逍遙散制備成1.4 g·mL－1的濃煎液，4℃保存?zhèn)溆?，方法同補腎疏肝方。

2.2 模型建立與分組給藥40只健康清潔級雌性KM小鼠，隨機分為4組，即空白組、模型組、補腎疏肝方聯(lián)合音樂組、逍遙散組，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠進行模型復(fù)制，模型建立方法如下：在慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）［14］模型的基礎(chǔ)上進行改進，刺激因子包括10種［15］：孤籠喂養(yǎng)；潮濕墊料；夾尾刺激1 min；0℃冰水游泳5 min；禁食24 h；禁水24 h；黑白顛倒；45°傾斜鼠籠；禁食水24 h；異物刺激24 h（如硬木棍，碎布片等）。10種刺激隨機安排，使小鼠無法預(yù)測刺激的發(fā)生，每天1次，每次1種刺激，連續(xù)21 d。

模型成功后，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組給予26 g·kg－1補腎疏肝方濃煎液灌胃，同時播放五行音樂，音樂選用中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社出版的《中國傳統(tǒng)五行音樂（正調(diào)式）》中的角調(diào)、羽調(diào)［16］，操作時，周圍環(huán)境安靜，音量適當(dāng)，時長45 min，兩種調(diào)式隔日播放，每日1次，連續(xù)21 d；逍遙散組給予28 g·kg－1逍遙散濃煎液灌胃；空白組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。動物給藥劑量按照人與小鼠給藥換算公式，取人與小鼠換算比例為9.1，每天灌胃體積為20 mL·kg－1［17］。

2.3 各組小鼠的一般情況觀察實驗開始后，每日觀察小鼠的一般情況（精神狀態(tài)、毛色、進食水量），并在造模前后及用藥后稱量小鼠的體質(zhì)量。

2.4 小鼠動情次數(shù)的觀察實驗開始后，每日上午9時進行小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，用移液器吸取生理鹽水20μL，注入小鼠陰道內(nèi)并反復(fù)抽吸3～5次，將其涂于載玻片上，固定、染色，在顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞的形態(tài)，以確定小鼠所處動情周期階段，通過連續(xù)涂片判定小鼠的動情次數(shù)。

2.5 糖水偏嗜度檢測每籠放置兩個50 mL飲水瓶，一個含1%的蔗糖水，一個含蒸餾水，1 h后取走兩瓶，并稱重，計算每只小鼠的糖水偏嗜度。于實驗第21天、42天開展糖水偏嗜度檢測實驗。

糖水偏嗜度＝蔗糖水消耗量／（蔗糖水消耗量＋蒸餾水消耗量）×100%

2.6 曠場實驗將小鼠放入自制的曠場箱中，自由活動5 min，計算小鼠在中央格的停留時間。于實驗第21天、第42天開展曠場實驗。

2.7 ELASA法檢測小鼠血清中E2、FSH的水平

嚴(yán)格按照ELASA試劑盒說明書操作檢測小鼠血清中E2、FSH的水平。將標(biāo)準(zhǔn)品及樣本加抗體孵育后，配液、洗滌、顯色，加終止液，在450 nm波長下測定OD值。

2.8 觀察小鼠卵巢組織病理變化取甲醛固定的卵巢組織，脫水、包埋、切片、HE染色后，將組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，組內(nèi)前后比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠一般情況的影響空白組小鼠狀態(tài)良好，被毛光滑，飲食、飲水正常；模型組小鼠被毛稀松，飲食、飲水均減少。與模型組相比，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組和逍遙散組，上述表現(xiàn)有所改善。對各組小鼠的體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)：造模結(jié)束后，與空白組比較，模型組、補腎疏肝方聯(lián)合音樂組和逍遙散組小鼠體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組和逍遙散組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 n 原始體質(zhì)量 造模后體質(zhì)量 給藥后體質(zhì)量空白組10 22.1±1.7 28.8±1.5 36.0±1.6模型組 10 22.8±1.8 26.3±1.6* 31.7±1.8*補腎疏肝方聯(lián)合音樂組10 22.1±1.3 27.2±0.7* 34.3±1.0△逍遙散組 10 23.1±1.4 27.3±1.4* 34.1±1.1△

3.2 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠動情次數(shù)的影響造模結(jié)束后，與空白組比較，造模小鼠的動情次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與空白組比較，模型組小鼠的動情次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組小鼠動情次數(shù)顯著增加（P＜0.05），作用效果與逍遙散相當(dāng)。見表2。

表2 各組小鼠造模后及用藥后動情次數(shù)比較 （xˉ±s）

3.3 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠糖水偏嗜度的影響造模結(jié)束后，與空白組比較，造模小鼠糖水偏嗜度明顯下降（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與空白組比較，模型組小鼠糖水偏嗜度明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組小鼠糖水偏嗜度明顯升高（P＜0.05），作用效果與逍遙散相當(dāng)。見表3。

表3 各組小鼠糖水偏嗜度比較 （±s，%）

表3 各組小鼠糖水偏嗜度比較 （±s，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 n 造模后 給藥后空白組10 4.3±0.8 5.1±0.7模型組 10 2.3±0.5* 1.7±0.3*補腎疏肝方聯(lián)合音樂組 10 2.4±0.3* 2.9±0.3△逍遙散組 10 2.6±0.2* 2.7±0.2△

3.4 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠曠場實驗中央格停留時間的影響造模結(jié)束后，與空白組比較，造模小鼠中央格停留時間明顯延長（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與空白組比較，模型組小鼠中央格停留時間明顯延長（P＜0.05）；與模型組比較，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組小鼠中央格停留時間明顯縮短（P＜0.05），作用效果與逍遙散相當(dāng)。見表4。

表4 各組小鼠曠場實驗結(jié)果比較 （±s，s）

表4 各組小鼠曠場實驗結(jié)果比較 （±s，s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 n 造模后 給藥后空白組10 3.9±0.5 4.9±0.7模型組 10 7.7±1.2* 12.4±0.8*補腎疏肝方聯(lián)合音樂組 10 7.6±1.1* 8.0±1.0△逍遙散組 10 7.7±1.0* 7.9±0.9△

3.5 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠E2、FSH水平的影響與空白組比較，模型組小鼠E2的水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)SH的水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組小鼠血清中E2的水平明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)SH雖有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠E2、FSH比較 （±s）

表5 各組小鼠E2、FSH比較 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 n E2（c／pmol·L－1）FSH／IU·L－1 10 17.46±1.28 2.94±0.80模型組 10 9.39±1.03* 7.86±1.83*補腎疏肝方聯(lián)合音樂組10 12.93.1±1.34△5.90±1.73逍遙散組 10 12.89±1.05△空白組5.95±1.02

3.6 補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠卵巢病理情況的影響空白組卵巢組織結(jié)構(gòu)清晰，可見各級卵泡，卵泡液含量較多，卵丘形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞較豐富，間質(zhì)血管較充盈，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組卵巢組織結(jié)構(gòu)破壞，卵泡數(shù)目減少，卵泡液含量較少，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，卵丘變形，少部分間質(zhì)血管擴張，可見炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組和逍遙散組小鼠的上述病理情況有所改善。見圖1。

圖1 各組小鼠卵巢組織病理情況（HE染色，×100）

4 討論

腎主生殖，主藏精，女性的生殖功能依賴于腎精的充盛；肝主疏泄，調(diào)暢氣機，“女子以肝為先天”，氣機順暢，方能促使腎精滋養(yǎng)全身，氣血充足，月水盈虧有序［18］。抑郁癥為情志類疾病，屬于“百合病”“郁證”的范疇，病位主要在肝，同時涉及五臟。肝主疏泄、行氣血、暢情志，肝氣調(diào)達(dá)，則局部組織營養(yǎng)輸布均勻［19］。當(dāng)機體受各種不良因素侵襲則影響氣機，阻滯沖任胞脈，導(dǎo)致卵泡微環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)輸布障礙，卵泡濡養(yǎng)不佳，造成卵泡閉鎖增多，引起卵巢的儲備功能降低［20］。

CUMS法建立抑郁動物模型，是目前公認(rèn)的方法。該方法復(fù)制的小鼠模型與臨床抑郁癥患者的表現(xiàn)較為接近。在建立模型的過程中，小鼠暴露在不可預(yù)見且溫和的刺激條件下，類似抑郁患者所處的生活環(huán)境，導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生異常的癥狀［21］，比如體質(zhì)量減輕，則與抑郁患者食欲不振、體質(zhì)量減輕的癥狀一致［22］。本研究開展的糖水實驗?zāi)M了抑郁患者平時生活興趣的缺失［23］；曠場實驗?zāi)M了抑郁患者平時生活自主活動力下降等［24］。本實驗中，與空白組比較，模型組小鼠造模后出現(xiàn)體質(zhì)量下降、糖水偏嗜度下降、中央格停留時間延長，說明慢性復(fù)合刺激導(dǎo)致了小鼠的肝郁狀態(tài)。與空白組比較，模型組小鼠動情次數(shù)、E2水平顯著下降，F(xiàn)SH水平顯著升高，且卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目減少，顆粒細(xì)胞分級減少，說明小鼠卵巢儲備功能下降。

腎虛是卵巢儲備功能減退的根本，而補腎作為治療卵巢儲備功能減退的主要方法，其臨床療效得到肯定。隨著生活節(jié)奏的加快，女性的社會壓力也不斷加大，社會心理是發(fā)病的另一個重要影響因素，長期慢性心理壓力，會導(dǎo)致女性卵巢功能減退［25－26］。筆者認(rèn)為，在DOR的治療中，補腎固然重要，但心理疏導(dǎo)也是很重要的一個環(huán)節(jié)。音樂療法可以提高大腦皮層神經(jīng)興奮性，在一定程度上緩解患者抑郁焦慮的情緒［27］。中醫(yī)五行音樂，將中醫(yī)陰陽五行、天人合一理論與音樂有機結(jié)合，角、徵、宮、商、羽五種調(diào)式分別對應(yīng)肝、心、脾、肺、腎五臟，音樂的旋律振動與機體的振動產(chǎn)生共鳴，與內(nèi)在臟腑、情志相吻合，從而達(dá)到調(diào)暢氣機、梳理情志的作用。角調(diào)有木的特性，可以梳理肝氣、解郁；羽調(diào)有水的特征，可以補腎氣［28－29］。因此，本文在探索慢性應(yīng)激狀態(tài)下卵巢儲備功能狀態(tài)的同時考察補腎疏肝法聯(lián)合音樂治療對其的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，補腎疏肝方聯(lián)合音樂組與逍遙散組小鼠的動情次數(shù)顯著增加，糖水偏嗜度明顯上升，中央格停留時間明顯縮短，E2水平顯著升高，卵巢組織結(jié)構(gòu)較清晰，可見各級卵泡，顆粒細(xì)胞較豐富，間質(zhì)血管較充盈，提示補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂能明顯促進卵巢功能的恢復(fù)。

綜上所述，肝郁狀態(tài)下小鼠卵巢儲備功能降低，補腎疏肝法聯(lián)合五行音樂對肝郁型小鼠卵巢功能的恢復(fù)有一定的促進作用。