劉晨笑，孟玥，孫治琪，趙永烈，劉子旺

北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

隨著人們生活節(jié)奏的加快，不規(guī)律的生活和飲食方式使得高血壓發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的高血壓是引起認(rèn)知功能障礙的主要危險(xiǎn)因素，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶、執(zhí)行等方面的認(rèn)知功能造成不同程度的損害［1］。中醫(yī)學(xué)將高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”等范疇，以肝陽(yáng)上亢證最為常見(jiàn)［2］。臨床上，中醫(yī)準(zhǔn)確的辨證論治收效明顯，但其作用機(jī)理尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立肝陽(yáng)上亢型高血壓認(rèn)知功能障礙模型，通過(guò)檢測(cè)模型大鼠血壓、認(rèn)知行為學(xué)、血清炎性因子及額葉病理?yè)p傷，探究天麻鉤藤顆粒防治高血壓認(rèn)知功能障礙可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）32只，清潔級(jí)，雄性，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；清潔級(jí)SD大鼠6只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012－0001，倫理批號(hào)：BUCM－4－2019092402－3070。實(shí)驗(yàn)室定期清潔、消毒，通風(fēng)良好，溫度20～25℃、濕度（55±2）%，晝夜間斷照明。

1.2 藥物與試劑附子湯（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房提供）；天麻鉤藤顆粒（成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200609）；尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20190207）。戊巴比妥鈉（天津市元立化工有限公司，批號(hào)：20190506）；無(wú)水乙醇、二甲苯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為：BH100591、20191208）；蘇木素染液（上海碧云天生物公司，批號(hào)：190916）；伊紅（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：190917）；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotides bind to oligomeric domain－like receptor 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis－associated spot－like protein，ASC）、Caspase－1試劑盒（武漢圣洛捷生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為：AE31893HU、AE58604HU、AE38730HU）。

1.3 儀器Softron BP－2010A型大鼠無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓儀（北京軟隆科技有限責(zé)任公司）；ZS－001moriss型水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－tek公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備附子湯制備方法：制附子（黑順片）浸泡30 min，煎煮兩次，將兩次藥液合并濃縮為含生藥量0.2 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

臨床上患者每天服用天麻鉤藤顆粒為30 g，尼莫地平片為60 mg。按照大鼠與人為6.25換算系數(shù)，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)大鼠天麻鉤藤顆粒灌胃劑量為3.125 g·kg－1，尼莫地平片灌胃劑量為6.25 g·kg－1。用蒸餾水把天麻鉤藤顆粒配制成31.25 g·mL－1藥液，尼莫地平片配制成62.5 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物模型制備及分組將32只SHRs大鼠，隨機(jī)取8只作為自發(fā)性高血壓組，其余大鼠連續(xù)給予附子湯（2 g·kg－1）28 d，復(fù)制自發(fā)性高血壓肝陽(yáng)上亢證大鼠模型［3－4］，然后將其分為SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組，另取6只正常SD大鼠為空白組，分別給予相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃42 d，空白組、對(duì)照組均給予同體積的蒸餾水42 d。

2.3 觀察大鼠的一般情況

2.3.1 大鼠的表觀指標(biāo)觀察大鼠毛發(fā)是否粗糙發(fā)黃、蓬松無(wú)光澤，形體是否消瘦，眼結(jié)合膜是否充血、顏色等。大鼠給藥后進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 易激惹程度評(píng)分的測(cè)定Ⅰ級(jí)：抓取大鼠頸部時(shí)狂躁、驚叫，為1分；Ⅱ級(jí)：抓取大鼠頸部時(shí)惱怒、傷人，有攻擊性，為2分；Ⅲ級(jí)：提捏大鼠尾部時(shí)驚叫、狂躁，同籠內(nèi)大鼠打斗激烈、撕咬鼠籠、傷人，攻擊性較強(qiáng)，為3分；無(wú)明顯現(xiàn)象記0分。大鼠于給藥后測(cè)量1次。

2.3.3 大鼠飲水量的測(cè)量將全部大鼠予單籠飼養(yǎng)，選擇帶有刻度值的250 mL專用滾珠型飲水瓶供水，觀察24 h飲水量變化，飲水瓶?jī)?nèi)水量變化加每日灌藥量即為每日飲水量。大鼠于給藥后測(cè)量1次。

2.4 Morris水迷宮的測(cè)試給藥第38天后，大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，共3 d，訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，第4天記錄大鼠在各象限入水點(diǎn)入水后找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。具體操作：將大鼠面朝壁分別于四個(gè)象限的入水點(diǎn)放入水迷宮內(nèi)，觀察并記錄找到平臺(tái)的時(shí)間；第4天撤去平臺(tái)，將大鼠于平臺(tái)對(duì)側(cè)入水點(diǎn)放入，觀察大鼠游泳軌跡并記錄60 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)，測(cè)試大鼠空間記憶能力。

2.5 血壓的測(cè)量水迷宮測(cè)試后對(duì)大鼠測(cè)量血壓，每只大鼠在靜息狀態(tài)下測(cè)量3次，取平均值。

2.6 血清指標(biāo)的檢測(cè)血壓測(cè)量后，用體積分?jǐn)?shù)5%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈血，4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，分離血清后，采用ELISA法檢測(cè)血清中NLRP3、Caspase－1、ASC水平。

2.7 觀察大鼠腦病理?yè)p傷變化腹主動(dòng)脈取血后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，剝離大腦額葉組織，40 ng·L－1多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，厚5μm，每片相距30μm，常規(guī)脫蠟后蘇木精－伊紅染色，封用。在顯微鏡下觀察大鼠腦病理?yè)p傷變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況空白組、對(duì)照組毛發(fā)柔順光澤、形體正常、眼結(jié)合膜無(wú)充血；SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)蓬松無(wú)光澤、形體消瘦、眼結(jié)合膜充血等。與空白組、對(duì)照組比較，SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠易激惹程度評(píng)分和飲水量均顯著增加（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

表1 對(duì)大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△△P＜0.01

組別 n易激惹程度評(píng)分／分 飲水量（V／mL）6 0.83±0.41 24.71±1.57對(duì)照組 8 1.50±0.76 24.51±2.04 SHRs肝陽(yáng)上亢證組 8 2.38±0.52**△△46.24±2.56**△△天麻鉤藤顆粒組 8 2.38±0.52**△△46.93±2.23**△△尼莫地平片組 8 2.5±0.53**△△47.33±3.09空白組**△△

3.2 對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試的影響與空白組、對(duì)照組比較，SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與SHRs肝陽(yáng)上亢證組比較，天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試的影響 （±s）

表2 對(duì)大鼠水迷宮測(cè)試的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與SHRs肝陽(yáng)上亢證組比較，＃P＜0.05

組別 n逃避潛伏期（t／s）目標(biāo)象限停留時(shí)間（t／s）穿越平臺(tái)次數(shù)／次6 25.99±3.28 34.04±1.77 5.58±1.26對(duì)照組 8 26.74±2.42 32.36±3.12 5.02±1.52 SHRs肝陽(yáng)上亢證組8 42.96±5.91*△24.22±2.67*△ 3.00±1.13*△天麻鉤藤顆粒組 8 29.62±5.65*△＃27.87±2.46*△＃4.99±1.16*△＃尼莫地平片組 8 30.40±3.52*△＃28.03±2.55*△＃5.03±1.09*△＃空白組

圖1 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖

圖2大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖

3.3 對(duì)大鼠血壓的影響與空白組比較，對(duì)照組、SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著升高（P＜0.01）；與對(duì)照組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓顯著降低（P＜0.05）、舒張壓顯著降低（P＜0.01）；與SHRs肝陽(yáng)上亢證組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

表3 對(duì)大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽(yáng)上亢證組比較，＃＃P＜0.01。1 mm Hg＝0.133 kPa

組別 n 收縮壓 舒張壓空白組6 116.00±9.63 87.50±3.15對(duì)照組 8 193.50±11.82** 140.88±5.74**SHRs肝陽(yáng)上亢證組 8 205.63±15.95** 137.00±7.96**天麻鉤藤顆粒組 8 183.50±29.44**△＃＃118.50±12.26**△△＃＃尼莫地平片組 8 172.38±22.82**△＃＃117.25±10.76**△△＃＃

3.4 對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響與空白組比較，對(duì)照組、SHRs肝陽(yáng)上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著升高（P＜0.01）；與對(duì)照組、SHRs肝陽(yáng)上亢組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

表4 對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽(yáng)上亢證組比較，＃＃P＜0.01

數(shù)量 NLRP3（ρ／μg·L－1） Caspase－1（c／nmol·L－1） ASC（ρ／ng·L－1）8.50±0.69 17.37±1.56 73.50±37.57對(duì)照組 8 13.78±0.87** 27.61±1.94** 182.35±36.45**SHRs肝陽(yáng)上亢證組 8 13.33±0.51** 24.10±2.56** 199.02±25.92**天麻鉤藤顆粒組 8 11.39±0.30**△△＃＃ 20.60±1.66**△△＃＃ 114.12±25.39**△△＃＃尼莫地平片組 8 11.28±0.43**△△＃＃ 20.16±3.65**△△＃＃ 125.79±17.67**△△＃?？瞻捉M6

3.5 對(duì)大鼠額葉病理學(xué)及尼氏染色的影響空白組、對(duì)照組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠額葉神經(jīng)元細(xì)胞輪廓清晰，排列規(guī)整、緊密，細(xì)胞核大而圓，處于胞體中心，核仁清晰可見(jiàn)，胞體充盈，細(xì)胞質(zhì)豐富；且天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組分別與空白組及對(duì)照組相比無(wú)明顯區(qū)別。SHRs肝陽(yáng)上亢證組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)變性、大小不等及結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核縮小，核仁不清。說(shuō)明天麻鉤藤顆粒和尼莫地平片能夠抑制神經(jīng)元變性。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 額葉HE染色（200×）

圖4 大鼠腦組織額葉尼氏染色（200×）

4 討論

隨著中國(guó)社會(huì)老齡化進(jìn)程不斷加快，高血壓的發(fā)病率逐年上升，截止到2017年，高血壓患病率已達(dá)到46.4%［5］，且由高血壓造成的認(rèn)知功能障礙也在持續(xù)進(jìn)行，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［6］。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓是認(rèn)知功能障礙發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［7－9］，高收縮壓（＞160 mm Hg）者血壓每升高10 mm Hg，誘發(fā)認(rèn)知能力減退的風(fēng)險(xiǎn)增加9%［10］。針對(duì)高血壓導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，西醫(yī)多予降壓、營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)等方法治療，臨床效果較好，但存在不良反應(yīng)，而中醫(yī)則注重調(diào)節(jié)整體，通過(guò)辨證論治選方用藥，降壓的同時(shí)又能減輕不良反應(yīng)，較西醫(yī)具有顯著優(yōu)勢(shì)［11］。

高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”范疇，其中以肝陽(yáng)上亢證最為常見(jiàn)［2］，認(rèn)知功能障礙則屬“癡呆”“健忘”之類。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多因肝陽(yáng)偏亢、肝腎陰虛日久，耗傷肝腎陰精，腎精虧虛，髓減腦消，神機(jī)失用，影響認(rèn)知功能。天麻鉤藤飲是臨床治療高血壓的代表方劑，該方出自胡光慈的《中醫(yī)內(nèi)科雜病證治新義》，由天麻、鉤藤、石決明、黃芩、梔子、益母草、牛膝、杜仲、桑寄生、茯神、夜交藤組成，具有平肝潛陽(yáng)、滋補(bǔ)肝腎之功效，與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头阶C對(duì)應(yīng)，并且干預(yù)42 d即可出現(xiàn)相關(guān)癥狀及指標(biāo)的變化［12－13］。研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平脂溶性好，能夠通過(guò)血腦屏障，有降壓作用，同時(shí)對(duì)認(rèn)知功能障礙亦有改善作用［14－15］。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用尼莫地平片作為對(duì)照組。

高血壓導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的西醫(yī)發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［16］，“高血壓是一種血管炎癥”這一說(shuō)法越來(lái)越受到醫(yī)者的認(rèn)可［17］，其中NLRP3炎癥小體在高血壓、認(rèn)知功能障礙等疾病發(fā)生進(jìn)程中具有重要作用［18－20］。NLRP3炎癥小體是由NLR蛋白、ASC、半胱氨酸蛋白酶前體（pro－caspase－1）共同組成的一種多蛋白多聚體，受到氧化應(yīng)激、微生物感染、免疫反應(yīng)等危險(xiǎn)因子時(shí)被激活形成巨大的炎癥小體復(fù)合物［21］，將Caspase－1前體（pro－caspase－1）剪切為生物活性較強(qiáng)的Caspase－1 P10片段，促使下游白細(xì)胞介素－18前體（pro－interleukin－18，pro－IL－18）和白細(xì)胞介素－1β前體（pro－interleukin－1β，pro－IL－1β）轉(zhuǎn)化成具有較強(qiáng)生物活性的IL－18和IL－1β等炎癥因子［22］，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)膽堿能抗炎通路（cholinergic anti－inflammatory pathway，CRP）、IL－6和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等多種炎癥細(xì)胞因子的成熟與分泌［23－24］。其中IL－18和IL－1β可激活核因子－κB（nuclear factorκB，NF－κB）信號(hào)通路，誘發(fā)腦神經(jīng)炎［25］；TNF－α可通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)或一系列的復(fù)合反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，加重局部炎癥，導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡及腦組織損傷［26］，出現(xiàn)認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)等腦功能障礙。加之長(zhǎng)期處于高血壓狀態(tài)下，血管平滑肌增生、內(nèi)皮損傷，血管通透性增加，促使了各種炎癥因子向腦組織的侵入，加重腦組織損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，與SHRs肝陽(yáng)上亢證組、對(duì)照組比較，天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清中NLRP3、ASC、Caspase－1水平顯著降低，且天麻鉤藤顆粒組亦低于尼莫地平片組。大腦額葉與認(rèn)知、執(zhí)行能力和情緒處理能力等功能密切相關(guān)［6］，通過(guò)觀察大鼠腦額葉病理?yè)p傷發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后，除SHRs肝陽(yáng)上亢證組出現(xiàn)腦皮質(zhì)水腫、神經(jīng)元變性，空白組、對(duì)照組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組組間無(wú)明顯區(qū)別。結(jié)合Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即干預(yù)后的天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期縮短、目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)增多等情況，提示天麻鉤藤顆粒能夠有效改善認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能是通過(guò)降低血清中的NLRP3炎癥小體，抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦額葉組織損傷，保護(hù)額葉神經(jīng)元，從而達(dá)到改善認(rèn)知功能的目的。有研究證明了癡呆與炎癥反應(yīng)的關(guān)系［27］，提出額葉皮質(zhì)損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［28］，也有研究證實(shí)天麻鉤藤飲能夠改善自發(fā)性高血壓肝陽(yáng)上亢證所致的認(rèn)知功能障礙［29－30］，均支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

綜上所述，天麻鉤藤顆粒能在一定程度上抑制NLRP3炎癥小體合成，保護(hù)額葉神經(jīng)元，改善模型大鼠認(rèn)知能力，這可能是其治療高血壓認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制。