黃佩珍，唐嵐芳，劉婷，鐘佳男，林瑤，許茜，蔡晶

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

帕金森病（parkinson′s disease，PD）是第二大神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病人群主要為65歲以上的老年人。中腦黑質(zhì)－紋狀體多巴胺神經(jīng)細胞的變性壞死，多巴胺遞質(zhì)缺乏和路易小體（lewy bodies，LBs）為其主要病理改變［1－2］。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在PD發(fā)病機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［3－4］。ERS無法逆轉(zhuǎn)時會促進相關(guān)凋亡蛋白（基因）的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求激酶1α（inositol requiring cnzymelα，IRE1α）、c－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）所介導(dǎo)的ERS信號通路可調(diào)控細胞凋亡［5－7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蓯蓉舒痙顆?？梢愿纳芇D模型大鼠的運動障礙和認(rèn)識功能［8－9］，但其作用機制還未明確。本研究通過觀察蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠腦黑質(zhì)TH表達及腦額葉皮質(zhì)IRE1α、p－IRE1α、JNK、P－JNK蛋白表達的影響，探討其對PD模型大鼠的作用。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠45只，8周齡，體質(zhì)量200～240 g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，許可證號：SCXK（浙）2019－0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，使用許可證號：SKYX（閩）2017－0006。飼養(yǎng)條件為室溫為20～22℃，相對濕度60%～65%，自動光暗控制。

1.2 藥物與試劑蓯蓉舒痙顆粒是本課題組已獲國家授權(quán)的專利（專利號為：2011103028541）（福建中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬人民醫(yī)院提供，由肉蓯蓉、丹參、制黃精、赤芍、牡丹皮等藥物組成）；葵花油、魚藤酮（美國Sigma公司，貨號分別為：A8007、H8923）；β－actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：66009）；IRE1α抗體、p－IRE1α抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號分別為：8680R、AP0878）；JNK抗體、p－JNK抗體（美國Abcam公司，貨號分別為：ab179461、ab207477）；烏拉坦（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：s11036）；SDSPAGE凝膠配置試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：p0012a）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Bio－Rad公司，貨號：b500022）；PVDF膜（北京索萊寶科技有限公司，貨號：w0162）；BCA蛋白定量試劑盒（福建邁新技術(shù)有限公司，貨號：pt0001）。

1.3 儀器電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司，型號：CP214）；制冰機（日本三洋電器集團，型號：SIM－F140）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5417R）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司，型號：TS100）；光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司，型號：Mdl）；石蠟切片機（德國Leica公司，型號：RM2235）；石蠟包埋機（孝感亞光醫(yī)用公司，型號：YB－7LF）；電泳儀（美國Bio－Rad公司，型號：PowerPac Basic）；轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio－Rad公司，型號：PowerPac Basic）；化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Bio－Rad公司，型號：Universal Hood）；恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機廠，型號：78HW－I）；實驗室超純水器（美國Millipore公司，型號：MILLI－Q）；展片機（德國FGL公司，型號：1052）。

2 方法

2.1 動物分組及造模將45只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組和蓯蓉舒痙顆粒（5.21 g·kg－1）組，除正常組外，其余各組大鼠采用頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液（1.5 mg·kg－1）（按1.5∶1將魚藤酮、葵花油配為魚藤酮葵花油乳液）制備PD模型［10－11］，連續(xù)給予14 d。造模過程中出現(xiàn)靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、步態(tài)姿態(tài)異常等癥狀則視為造模成功。正常組正常喂養(yǎng)，不予處理。

2.2 干預(yù)方法蓯蓉舒痙顆粒人的用量為50 g（生藥）·60 kg－1，按照成人與大鼠給藥量換算得大鼠給藥劑量為5.21 g·kg－1，每天1次，連續(xù)給藥14 d，正常組和模型組則給予同體積的蒸餾水灌胃。

2.3 免疫組化法檢測大鼠腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表達每組隨機取4只大鼠，用體積分?jǐn)?shù)20%烏拉坦腹腔麻醉，心臟灌注后，取完整的腦組織固定于40 ng·L－1多聚甲醛，脫水浸蠟，包埋后的組織塊放于切片機標(biāo)本固定架上，切片厚度為4μm，再放入58℃烘箱中烘片6～8 h；脫蠟30 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ復(fù)水5 min后，依次在100%乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脫水5 min，PBS沖洗3次，每次5 min；高溫修復(fù)后待自然冷卻，PBS沖洗3次，每次5 min；用3%H2O2再孵10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；封閉2 h，滴加TH（1∶200）一抗孵育，將切片放入37℃烘箱復(fù)溫30 min，再用DAB顯色液顯色，放入純水中停止顯色；將切片吹干，用樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.4 Western Blot法檢測大鼠額葉相關(guān)蛋白表達

每組隨機選擇6只大鼠，用體積分?jǐn)?shù)20%烏拉坦腹腔麻醉后，斷頭留腦，將其放置于冰盤上，切下額葉部分，提取蛋白后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，按4∶1加上樣緩沖液，將樣品放入沸水中變性。配膠，上樣至10%SDS－PAG電泳，電壓20 V／10 min、80 V／30 min、120 V／60 min，使蛋白跑到膠底部，按蛋白分子量大小切下所需要條帶，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，2 h后放入配好的IRE1α、p－IRE1α、JNK、p－JNK、β－actin抗體（抗體∶抗體稀釋液＝1∶1 000），4℃孵育，用TBST洗膜，然后將條帶放于二抗（抗體∶抗體稀釋液＝1∶2 000）中，搖床中孵1 h后，將ECL發(fā)光液加到PVDF膜上進行曝光成像。用ImageLab軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊則采用Games－Howell法。P＜0.05則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠腦黑質(zhì)HT陽性表達的影響與正常組比較，模型組大鼠腦黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，蓯蓉舒痙顆粒組大鼠腦黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠腦黑質(zhì)HT陽性表達的影響

3.2 蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠腦額葉相關(guān)蛋白表達與正常組比較，模型組大鼠腦額葉p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蓯蓉舒痙顆粒組大鼠腦額葉p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠腦額葉相關(guān)蛋白表達

4 討論

PD是次于癡呆的第二大常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，現(xiàn)階段PD的病因并未明確，患者早期有運動遲緩、弓背、靜止性震顫等癥狀［12－13］。隨著病情發(fā)展加重，伴發(fā)抑郁［14－15］、焦慮［16－17］等精神性癥狀和喪失部分生活自理能力，這給家庭及社會帶來巨大的壓力［18］。

帕金森病屬于中醫(yī)學(xué)“震顫”“痙證”等范疇，基本的病機為本虛標(biāo)實，肝腎虧虛、氣血不足為本，風(fēng)、火、痰、瘀為標(biāo)。腎藏精生髓，腦為髓之海，腎虛則精不上承而腦髓空虛；腎精虧虛，水不涵木，則虛風(fēng)內(nèi)動，發(fā)為震顫；腎精虧虛，筋脈失于濡養(yǎng)，加重震顫，因此需要補腎益髓。蓯蓉舒痙顆粒的君藥為肉蓯蓉，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效，有保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老、提高免疫力等藥理作用［19－20］。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉的有效成分松果菊苷對PD模型大鼠海馬及細胞外液的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少有保護作用［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉有效成分肉蓯蓉多糖可以改善PD模型大鼠的癥狀，上調(diào)腦黑質(zhì)Wnt1、β－catenin蛋白表達，降低GSK－3βmRNA水平，對DA能神經(jīng)細胞有保護作用［22］。本課題組前期臨床試驗表明，蓯蓉舒痙顆?？梢愿纳苹颊咝袨槟芰Α⒔档团两鹕喜【C合評分［23］，還可以改善PD模型大鼠行為障礙、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平和線粒體氧化應(yīng)激水平［24－25］。

長時間的ERS，內(nèi)皮網(wǎng)上的蛋白質(zhì)負(fù)載超過其折疊能力時，可誘導(dǎo)細胞凋亡?？缒さ鞍譏RE1α［26］分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，由N端腔傳感器結(jié)構(gòu)域，單個跨膜結(jié)構(gòu)域和C端胞質(zhì)效應(yīng)子組成，調(diào)控蛋白激酶、核糖核酸內(nèi)切酶的活性?？缒さ鞍譏RE1α也可誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)細胞凋亡，其結(jié)合TRAF2（腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2）、ASK1（凋亡信號調(diào)節(jié)激酶），形成TRAF2－ASK1－JNK復(fù)合體，從而激活JNK通路?；罨腏NK（絲裂原活化蛋白激酶）可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl－2或直接激活Bcl家族中的Bax，促使細胞凋亡［27－29］。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)魚藤酮造模后，PD模型大鼠有靜止性震顫、運動遲緩、弓背、姿態(tài)步態(tài)異常等行為學(xué)障礙，其黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元明顯缺失；經(jīng)蓯蓉舒痙顆粒劑治療后，多巴胺神經(jīng)元缺失數(shù)量較模型組有所減少，表明蓯蓉舒痙顆粒對腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元有一定的保護作用。同時也可降低大鼠腦額葉p－IRE1α／IRE1α、p－JNK／JNK水平，表明蓯蓉舒痙顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)IRE1α／JNK通路來緩解ERS，從而保護PD模型大鼠的神經(jīng)元功能。但本研究中未對IRE1α／JNK信號通路中所有相關(guān)蛋白進行檢測及缺少PD模型大鼠行為學(xué)的檢測，故有待進一步研究。