江國華，譚燕平，陳宣睿，陳嘉南，徐鴻棋，朱 晟，伍遠(yuǎn)平，陳躍洲

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518172；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

糖尿病足潰瘍是指糖尿病患者因肢端神經(jīng)血管異常而繼發(fā)的足部感染或潰瘍。糖尿病足潰瘍是導(dǎo)致糖尿病患者截肢、死亡的重要因素[1]。糖尿病足潰瘍?cè)谥嗅t(yī)學(xué)中屬于“脫疽”、“消渴”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為濕熱與毒瘀是此病的主要致病因素[2]。近年來，中醫(yī)在糖尿病足潰瘍的治療中逐漸得到應(yīng)用，并取得了較好的效果[3]。中藥蚓黃散由黃柏、地龍、血竭三味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕的功效，能促進(jìn)糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面的愈合，降低其截肢的發(fā)生率[4]。相關(guān)的研究表明，清熱解毒類中藥可改善血清晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products AGEs）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子的水平，延緩糖尿病足潰瘍的進(jìn)展[5]。蚓黃散作為清熱解毒類中藥制劑，對(duì)糖尿病足潰瘍的治療效果已得到臨床證實(shí)，但其確切的作用機(jī)制尚不清楚[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定的信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。該學(xué)科可從整體出發(fā)，針對(duì)中藥制劑的配伍、作用規(guī)律等進(jìn)行不同層次的網(wǎng)絡(luò)篩選，構(gòu)建多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的分子機(jī)制，現(xiàn)已成為中藥復(fù)方研究的新方法[7-9]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”多維網(wǎng)絡(luò)，探究應(yīng)用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制，為蚓黃散的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 蚓黃散藥物活性成分的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）并結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)，獲得蚓黃散的全部化學(xué)成分，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類 藥 性（Drug-Likeness，DL）≥0.18為篩選條件[10-11]，確定候選化合物，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www. uniprot.org）規(guī)范其靶點(diǎn)名稱。

1.2 糖尿病足潰瘍疾病靶點(diǎn)的篩選

通 過GeneCards數(shù) 據(jù) 庫（https://www.genecards.org）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）以“Diabetic foot ulcer”為關(guān)鍵詞檢索出與糖尿病足潰瘍相關(guān)的基因。

1.3 構(gòu)建蚓黃散成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建蚓黃散成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并分析成分與靶蛋白之間的相關(guān)性。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinproteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將上述預(yù)測的可能靶標(biāo)輸入STRING 10.5數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，并得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）分別進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.6 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.7.2軟件合并蚓黃散與靶點(diǎn)蛋白的相關(guān)信息、信號(hào)通路與靶點(diǎn)蛋白的相關(guān)信息，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果

利用TCMSP平臺(tái)檢索出蚓黃散中的黃柏含有140種活性成分，通過其他數(shù)據(jù)庫檢索出蚓黃散中的血竭含有10種活性成分，地龍含有3種活性成分。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選，最終篩選出50個(gè)候選化合物。

2.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

在Cytoscape 3.7.2軟件中利用蚓黃散篩選出的成分與靶點(diǎn)信息，構(gòu)建蚓黃散成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（詳見圖1）。圖1中有136個(gè)節(jié)點(diǎn)和1018條邊，包括30個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)（綠色）、106個(gè)靶節(jié)點(diǎn)（藍(lán)色）?；衔锏亩戎翟礁?，則其在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的邊越多，在網(wǎng)絡(luò)中起越關(guān)鍵的作用。在蚓黃散的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，度值靠前的化合物分別為槲皮素（quercetin）、異紫堇杷明（Isocorypalmine）、氫化小檗堿〔(S)-Canadine〕、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)分別為70、37、35、33、33。由此可見，槲皮素、異紫堇杷明、氫化小檗堿、β-谷甾醇、豆甾醇可能是蚓黃散發(fā)揮藥效的主要成分。度值靠前的靶點(diǎn)分別為AR、ESR1、PPARG、NOS2，這些靶點(diǎn)可能是蚓黃散發(fā)揮藥效的主要靶點(diǎn)。

圖1 蚓黃散的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 蚓黃散與糖尿病足潰瘍的交集靶點(diǎn)

利用TCMSP共查詢出蚓黃散預(yù)測效靶106個(gè)，同時(shí)從Genecards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫收集糖尿病足潰瘍的相關(guān)靶點(diǎn)2398個(gè)，將二者取交集后得到應(yīng)用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的可能靶標(biāo)76個(gè)。詳見圖2。

圖2 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集基因的維恩圖

2.4 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集的PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING 10.5數(shù)據(jù)庫中對(duì)上述76個(gè)交集蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，得到圖3。圖3中有76個(gè)節(jié)點(diǎn)、1310條邊，平均度值為17.24。其中各節(jié)點(diǎn)表示作用靶點(diǎn)，靶點(diǎn)之間的彼此關(guān)系用邊表示，邊數(shù)越多表明該節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)越重要。由度值得出主要作用靶點(diǎn)的信息條形圖（詳見圖4）。由圖4可知，白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、JUN基因、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、IL-1β排序靠前，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的聯(lián)系作用，可能是關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)。

圖3 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集的PPI圖

圖4 互作關(guān)系排名靠前的相關(guān)靶標(biāo)

2.5 基因功能和通路分析結(jié)果

應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析（詳見圖5、圖6）。在KEGG通路富集分析中排名靠前且與糖尿病足潰瘍聯(lián)系密切的通路包括PI3KAkt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥相關(guān)通路（Pathways in cancer）、TNF信 號(hào) 通 路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等。

圖5 蚓黃散靶標(biāo)的GO功能富集分析

圖6 用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍相關(guān)靶蛋白的KEGG通路富集分析

2.6 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路

蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的藥物活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路詳見圖7。圖7中含30個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)（綠色）、76個(gè)靶節(jié)點(diǎn)（藍(lán)色）及20個(gè)通路（紫色），篩選出的蚓黃散藥物活性成分可通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)而調(diào)控多條信號(hào)通路，從而協(xié)同發(fā)揮治療糖尿病足潰瘍的作用。

圖7 蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的藥物活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖

3 討論

糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的過程由多種細(xì)胞因子、炎性因子共同參與。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展與糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合程度密切相關(guān)[12]。李友山等[13]研究指出，炎癥反應(yīng)始終貫穿糖尿病足潰瘍的病理過程，這與祖國醫(yī)學(xué)中“濕熱與毒瘀”的致病特點(diǎn)極為相似，而蚓黃散具有明顯的抗炎作用，可用于治療糖尿病足潰瘍。進(jìn)一步發(fā)掘并分析蚓黃散潛在的藥理機(jī)制，對(duì)應(yīng)用此藥治療糖尿病足潰瘍具有重要的意義。本研究通過進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，蚓黃散中的藥物活性成分主要為槲皮素、異紫堇杷明、氫化小檗堿、β-谷甾醇、豆甾醇等。有報(bào)道稱，槲皮素可通過下調(diào)TNF-α、IL-1等炎性因子的表達(dá)及下調(diào)PI3K-Akt信號(hào)通路而抑制炎癥反應(yīng)[14]。本研究通過分析交集蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，蚓黃散中的有效成分可能是通過作用于IL-6、VEGFA、JUN基因、PTGS2、EGF、IL-1β等靶點(diǎn)而起作用。IL-6、IL-1β、PTGS2主要參與機(jī)體的各種炎癥反應(yīng)[15-16]。VEGFA在血管形成中起到重要的作用，糖尿病足潰瘍患者因血管內(nèi)皮功能遭到破壞，故可導(dǎo)致其血清VEGFA的水平下降[17]。本研究通過進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、PTGS2、VEGFA主要在PI3K-Akt信號(hào)通路上富集，而PI3K-Akt信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究指出，蚓黃散中的黃柏在抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的過程中也可使環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）失活，其抗炎作用與下調(diào)PI3K-Akt信號(hào)通路極為相似[18-19]。這表明，應(yīng)用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍是通過多生物途徑、多信號(hào)通路共同起作用的。

綜上所述，蚓黃散可通過多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路協(xié)同治療糖尿病足潰瘍。但本研究僅通過生物信息學(xué)手段對(duì)蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的機(jī)制進(jìn)行初步分析，存在一定的局限性，日后需對(duì)蚓黃散可能存在的治療靶點(diǎn)、作用通路等加以驗(yàn)證。