吳建麗,張良,劉雙嶺,賈坤平,朱紫薇,付新,陸閣玲,孫忠人

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150040）

睡眠對(duì)人類(lèi)記憶形成和鞏固具有重要的生物學(xué)作用[1],隨著生活方式的改變和多重壓力的增大,各種原因引起的睡眠時(shí)間減少或睡眠質(zhì)量下降已成為生活中常態(tài),醫(yī)學(xué)上將機(jī)體每日總睡眠時(shí)間少于 4 h超過(guò) 3個(gè)月以上的狀態(tài)稱(chēng)為慢性睡眠剝奪（chronic sleep deprivationm,CSD）。研究顯示睡眠不足能夠?qū)е聶C(jī)體注意力、記憶力及執(zhí)行力下降,使大腦變得遲鈍[2],還能抑制β淀粉樣蛋白的代謝加快阿爾茲海默病的發(fā)病進(jìn)程[3]。認(rèn)知水平下降雖不危及生命,卻嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)和工作效率,降低日常生活質(zhì)量。然而目前CSD引發(fā)認(rèn)知障礙的發(fā)病機(jī)制尚不明確,且缺乏有效的防治手段。針灸是中醫(yī)學(xué)中的特色外治療法,在治療失眠、抑郁等神經(jīng)功能性疾病方面有顯著的臨床療效[4]。課題組前期研究[5]表明,電針可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡而恢復(fù)睡眠覺(jué)醒周期。本研究將進(jìn)一步觀(guān)察電針對(duì) CSD發(fā)生后學(xué)習(xí)記憶能力的影響,并通過(guò)海馬內(nèi)谷氨酸（glutamate,Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）神經(jīng)遞質(zhì)含量及 N-甲基-D-天冬氨酸受體（n-methyl-D-aspartate receptor,NR）亞基 NR2A、NR2B的變化,初步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)Wistar大鼠24只,雄性,6～7周齡,體質(zhì)量（190±10） g,購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心,許可證號(hào)[SYXK（黑）2016004]。在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),溫度（22～24） ℃,相對(duì)濕度50%～70%,自由攝食和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處置符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。將篩選出的24只大鼠按體質(zhì)量大小編號(hào),用SPSS24.0軟件生成隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行分組,分為大平臺(tái)對(duì)照組（tank control,TC）、模型組（model,M）和電針組（Electro-acupuncture,EA）,每組8只。

1.2 主要儀器和試劑

微電流刺激儀（美國(guó) BioMedical Life System）,Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）,睡眠剝奪箱（自制）,大鼠 Glu ELISA試劑盒（ml037094-1,上海酶聯(lián)生物研究所）,大鼠 GABAELISA試劑盒（ml003128-1,上海酶聯(lián)生物研究所）,RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、上樣緩沖液、彩色預(yù)染Maker、封閉液、一抗二抗稀釋液及超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）,NMDAR2A Rabbit Polyclonal抗體（28571-1-AP,美國(guó) Proteintech公司）,GRIN2B Rabbit Polyclonal抗體（21920-1-AP,美國(guó)Proteintech公司）,GAPDH（10494-1-AP,美國(guó)Proteintech公司）,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）（SA00001-2,美國(guó)Proteintech公司）,PVDF膜（美國(guó)Millipore）。

1.3 模型制備

采用改良的多平臺(tái)水環(huán)境法建立 CSD模型[6]。將造模大鼠置于睡眠剝奪箱內(nèi)進(jìn)行異相睡眠剝奪,箱體大小為100 cm×60 cm×50 cm,內(nèi)部固定直徑為6.5 cm的圓形小平臺(tái)共8個(gè),平臺(tái)間距15 cm,高8 cm,箱體內(nèi)注入自來(lái)水,水面在平臺(tái)下約 1.0 cm。距平臺(tái)上方約15 cm處用鐵絲網(wǎng)遮蓋并放置食物和水瓶。正式實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于睡眠剝奪箱適應(yīng) 5 d,每日 1次,每次2 h。造模時(shí),給予24 h日光燈照射,每日16:00至次日10:00進(jìn)行睡眠剝奪18 h,然后恢復(fù)睡眠6 h,連續(xù)睡眠剝奪21 d形成模型,其中大平臺(tái)對(duì)照組睡眠剝奪箱內(nèi)的平臺(tái)上放置一張細(xì)密的鐵絲網(wǎng),確保大鼠在相似的水環(huán)境內(nèi)可以自由活動(dòng)和睡眠。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為大鼠表現(xiàn)為活動(dòng)減少,精神疲憊,反應(yīng)遲鈍,大量脫毛及體質(zhì)量減輕的癥狀,水迷宮檢測(cè)逃避潛伏期成倍的延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)成倍減少。

1.4 干預(yù)治療

電針組選取雙側(cè)風(fēng)池和供血穴進(jìn)行治療,參照大鼠穴位圖[7]和項(xiàng)部腧穴神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)[8],結(jié)合比較解剖學(xué)方法進(jìn)行定位。風(fēng)池穴位于大鼠天門(mén)穴（即枕骨頂嵴后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處）旁開(kāi)約2 mm;供血穴位于風(fēng)池穴直下約 0.5 cm,相當(dāng)于第 4頸椎棘突旁 2 mm。采用0.16 mm×7 mm毫針從項(xiàng)部向鼻尖方向刺入3～4 mm,針柄連接微電流刺激儀,正極在上,負(fù)極在下,刺激頻率2 Hz,電流強(qiáng)度0.5 mA,連續(xù)疏波刺激,以大鼠無(wú)躁動(dòng)、項(xiàng)部肌肉輕微收縮為度,刺激20 min,每日1次,連續(xù)治療14 d。大平臺(tái)對(duì)照組和模型組給予相同時(shí)間和方式的捆綁固定,但不進(jìn)行治療。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 水迷宮測(cè)試

干預(yù)后分別進(jìn)行定位航行和空間探索測(cè)試以評(píng)價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)在隔音、較暗的環(huán)境進(jìn)行。水迷宮由直徑為1.5 m的圓形水池和直徑10 cm、高15 cm的平臺(tái)組成,正上方安裝有攝像頭。實(shí)驗(yàn)前將水池注入溫水,加入墨汁,平臺(tái)低于水面約2 cm。定位航行實(shí)驗(yàn)將平臺(tái)固定在第Ⅳ象限,將大鼠分別從 4個(gè)象限固定一點(diǎn)面向池壁放入水中,若90 s內(nèi)找到平臺(tái)則在上面停留10 s,若90 s內(nèi)未找到平臺(tái)則引導(dǎo)至平臺(tái)并停留10 s,如此訓(xùn)練5 d,每次大鼠找到隱藏在水下平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期（escape Latency,EL）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在第 5天定位航行測(cè)試后,將平臺(tái)移走,2 h后將各組大鼠固定從第Ⅱ象限放入水中,記錄90 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)（transition,T）。

1.5.2 ELISA檢測(cè)Glu和GABA的含量

取腦組織后在冰上迅速剝離海馬,然后置于液氮中速凍,冰浴下勻漿至組織完全裂解,4 ℃,12000 r/min離心10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱待測(cè),按照相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5.3 Wb法檢測(cè)海馬內(nèi)NR2A、NA2B蛋白表達(dá)

取1.5 mLEP管,依次加入海馬組織、RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑,比例為1:10:1,冰浴裂解15 min,然后用組織研磨器冰上研磨 2 min,3000 r/min離心10 min,小心吸取上清液至已標(biāo)號(hào)的EP管內(nèi)。按照BCA試劑盒說(shuō)明,用酶標(biāo)儀于562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣本上清液的吸光度,計(jì)算出總蛋白的濃度,并對(duì)所有樣本的總蛋白濃度進(jìn)行配平,加入上樣緩沖液后高溫煮沸5 min,室溫晾涼后備用。經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉室溫 1.5 h、一抗室溫孵育 1.5 h（NR2A稀釋1:500,NA2B稀釋1:1 000）、二抗室溫孵育45 min（稀釋1:10 000）,加入ECL發(fā)光液曝光。用Image J分析軟件將條帶灰度值數(shù)字化,目的蛋白與內(nèi)參 GAPDH的灰度比值代表相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)多組間比較采用one-way ANOVA分析,方差齊組間均數(shù)兩兩比較用LSD檢驗(yàn);若方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀(guān)察

造模后,M組和EA組大鼠反應(yīng)遲鈍懶動(dòng),瞇眼弓背蜷縮,精神疲憊,毛發(fā)嚴(yán)重脫落失去光澤,易驚恐和被激惹,有相互撕咬導(dǎo)致腳趾、尾部破損出血的現(xiàn)象,攝食飲水量下降,大便稀臭,體質(zhì)量減輕;TC組大鼠則表現(xiàn)正常。14 d干預(yù)后,EA組大鼠反應(yīng)靈敏,自主活動(dòng)增多,有警惕性,毛發(fā)脫落較少有光澤,進(jìn)食量逐漸增多,體質(zhì)量緩慢增加,而M組大鼠則反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)量少和容易被激惹。

2.2 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化

隨著訓(xùn)練次數(shù)增加,各組大鼠尋找水下平臺(tái)所需的時(shí)間逐漸縮短。與TC組比較,M組每日的逃逸潛伏期（EL）明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,且第5天穿越平臺(tái)次數(shù)（T）亦有顯著的差異（P＜0.01）。與M組比較,第5天時(shí)EA組EL明顯縮短,T顯著增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的比較

2.3 各組大鼠海馬Glu、GABA含量的變化

結(jié)果顯示與TC組比較,M組大鼠海馬Glu含量明顯減少,GABA含量明顯增多,Glu/GABA比值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與M組比較,EA組大鼠海馬Glu含量增多,GABA含量降低,Glu/GABA比值顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的比較（±s）

表1 各組大鼠海馬內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的比較（±s）

注:與TC組比較1）P＜0.01;與M組比較2）P＜0.01

組別 n Glu（mg/L） GABA（μmol/L） Glu/GABA TC組 8 76.99±4.68 4.01±0.48 19.52±3.27 M 組 8 53.84±5.931） 5.59±0.621） 9.75±1.661）EA組 8 71.16±4.432） 4.26±0.482） 16.79±1.202）

2.4 各組大鼠海馬NR2A、NR2B蛋白表達(dá)的變化

Wb結(jié)果表明,與TC組比較,M組大鼠海馬區(qū)NR2A和NR2B蛋白相對(duì)灰度值明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與 M組比較,經(jīng)電針治療后,海馬區(qū) NR2A和 NR2B蛋白表達(dá)均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01,P＜0.05）,詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)谷氨酸受體NR2A、NR2B蛋白表達(dá)水平（±s,n＝6）

3 討論

針灸治療失眠已得到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可[9],臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)針刺不但能恢復(fù)睡眠功能,對(duì)睡眠不足引發(fā)的認(rèn)知損傷也有很好的改善作用[10]。風(fēng)池穴是膽經(jīng)要穴,又為少陽(yáng)經(jīng)與陽(yáng)蹺脈的交會(huì)穴,針刺風(fēng)池穴既可疏調(diào)膽氣有安神定驚的作用,又可通過(guò)調(diào)理蹺脈而平衡陰陽(yáng),從而治療失眠。供血穴為頸夾脊穴,位于督脈與膀胱經(jīng)之間,此二經(jīng)均上行入腦,針刺供血穴可通過(guò)刺激二經(jīng)起到開(kāi)竅益智、鎮(zhèn)靜醒腦之功?，F(xiàn)代研究[11]也表明,風(fēng)池和供血穴可促進(jìn)椎-基底動(dòng)脈血液循環(huán)而改善腦功能,還能調(diào)節(jié)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)恢復(fù)大腦皮質(zhì)興奮與抑制平衡,活化腦細(xì)胞,從而恢復(fù)睡眠-覺(jué)醒周期。

睡眠有助于記憶形成,學(xué)習(xí)也影響著睡眠結(jié)構(gòu)[12]。睡眠周期中,快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠（rapid eye movement sleep,REMs）在記憶形成和鞏固中發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者[13-14]報(bào)道,學(xué)習(xí)強(qiáng)度越大、頻率越高,REMs出現(xiàn)越早,在睡眠周期中所占比例也顯著增多,當(dāng)剝奪REMs后,學(xué)習(xí)能力則明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn),與TC組相比,M組大鼠EL明顯延長(zhǎng),T顯著減少,說(shuō)明CSD后即使恢復(fù)大鼠正常睡眠,認(rèn)知功能也未能完全恢復(fù);經(jīng)治療后,EA組EL較M組明顯縮短,T顯著增多,說(shuō)明在既往證明電項(xiàng)針改善睡眠功能的基礎(chǔ)上,本次實(shí)驗(yàn)也明確了電項(xiàng)針能提高CSD后學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)神經(jīng)功能,是腦神經(jīng)元對(duì)信息獲取、編碼、存儲(chǔ)和提取的復(fù)雜過(guò)程,突觸是保證這一過(guò)程順利完成的重要結(jié)構(gòu)。Glu是突觸傳遞的興奮性遞質(zhì),其釋放后可與突觸后膜上 NR受體結(jié)合,促進(jìn)鈣離子內(nèi)流維持長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),從而提高記憶能力。NR2A和NR2B是NR受體的兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基,與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系最為密切,NR2B甚至被稱(chēng)為“記憶基因”[15]。有研究[16-17]報(bào)道,促進(jìn)NR2A或NR2B過(guò)度表達(dá)可使小鼠學(xué)習(xí)記憶明顯提高,反之,抑制表達(dá)則學(xué)習(xí)能力明顯受損。GABA是腦內(nèi)的抑制性遞質(zhì),能降低大腦興奮性而抑制突觸傳遞。研究表明Glu/GABA比值過(guò)高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,導(dǎo)致神經(jīng)元受損出現(xiàn)認(rèn)知障礙,而比值過(guò)低也會(huì)抑制突觸可塑性形成和記憶的存儲(chǔ)[18]。本研究中,與TC組比較,M組海馬Glu含量、Glu/GABA比值、NR2A和NR2B表達(dá)明顯降低,GABA含量上升,表明了慢性睡眠剝奪后Glu和GABA的濃度失衡,谷氨酸受體減少導(dǎo)致了突觸傳遞效率下降,從而造成記憶損害。經(jīng)電針治療后,大鼠Glu、GABA、Glu/GABA、NR2A和NR2B受體表達(dá)水平較M組均明顯改善,說(shuō)明電項(xiàng)針能恢復(fù)Glu/GABA的分泌平衡,上調(diào)NR2A和NR2B的表達(dá)而改善記憶功能。

綜上所述,電針具有提高慢性睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)海馬內(nèi) Glu/GABA的分泌平衡,上調(diào)谷氨酸受體亞基NR2A和NR2B受體的表達(dá)水平,誘導(dǎo)和維持長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng),提高突觸可塑性有關(guān)。