鄭錦彪 朱久紅 袁敏

(上海譜實(shí)生態(tài)環(huán)境科技有限公司，上海 201717)

藍(lán)莓是一種高經(jīng)濟(jì)價值、高附加值的農(nóng)作物，具有防衰老、增強(qiáng)心臟功能、明目和防癌抗癌的功效，被譽(yù)為“水果中的皇后”，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1]。美國農(nóng)業(yè)部預(yù)測，藍(lán)莓將是21世紀(jì)世界范圍內(nèi)最具發(fā)展?jié)摿Φ墓麡錁浞N。2008年北美藍(lán)莓種植面積達(dá)10萬hm2，收獲總產(chǎn)量近30萬t。日本2008年全國藍(lán)莓種植面積1000hm2，產(chǎn)量約8000t，僅夠國內(nèi)需求量的10%，每年需進(jìn)口6萬t。從全球看，目前約有30多個國家栽培藍(lán)莓，總面積約14萬hm2，產(chǎn)量約35萬t，僅能滿足需求量的40%～50%。因此，藍(lán)莓發(fā)展有著巨大的國際市場空間，國際前景誘人[2]。

藍(lán)莓在生產(chǎn)過程中由于防治病蟲害而農(nóng)藥使用不規(guī)范，容易造成藍(lán)莓果實(shí)農(nóng)藥殘留超標(biāo)，必須對其進(jìn)行監(jiān)測，以保證藍(lán)莓的食用安全。目前，藍(lán)莓多種農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-7]。傳統(tǒng)多農(nóng)殘檢測的樣品前處理存在過程復(fù)雜、試劑用量大、周期長等缺陷，不利于市場對農(nóng)殘檢測的要求。QuEChERS是一種常用的樣品前處理技術(shù)，其方法原理是利用吸附劑填料與樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。均質(zhì)后的樣品經(jīng)乙腈提取后，采用萃取鹽鹽析分層后，利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，通過離心方式去除，從而達(dá)到凈化的目的。QuEChERS方法具有快速、簡單、廉價、高效、安全，且有機(jī)溶劑用量少的優(yōu)點(diǎn)，減少了環(huán)境污染，被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、生物等領(lǐng)域。藍(lán)莓中農(nóng)藥殘留的檢測，因其色素含量高、基質(zhì)復(fù)雜等因素面臨眾多困難。目前已有研究報道[8]基于QuEChERS-LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對漿果中多種農(nóng)藥殘留的測定，但農(nóng)藥監(jiān)測品種只有10種，范圍比較小不宜拓展。本研究借鑒以前的研究成果[9，10]，通過優(yōu)化QuEChERS前處理方法，采用添加1%甲酸的乙腈作為提取劑，添加PAS和炭黑吸附劑去除基質(zhì)中的色素和有機(jī)酸，最后利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)實(shí)現(xiàn)快速對藍(lán)莓40種常用農(nóng)藥品種的多農(nóng)殘組分同時分析，此方法操作簡便、高效，定性和定量結(jié)果準(zhǔn)確，值得進(jìn)一步推廣。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑

1.1.1 藍(lán)莓樣品

上海青浦現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)直接采摘的新鮮藍(lán)莓。

1.1.2 試劑及耗材

乙腈(色譜純，Merck公司)，甲酸(色譜純，Merck公司)，Waters QuEChERS凈化包(QuEChERS 900mg MgSO4加300mg PSA,15mL Tube；QuEChERS 900mg MgSO4,300mg PSA加300mg C18,15mL Tube；QuEChERS 1200mg MgSO4加400mg PSA,15mL Tube；QuEChERS 1200mg MgSO4,400mg PSA加400mg C18,15mL Tube)；純水，Milli-Q純水。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

甲胺磷、氧樂果、霜霉威、涕滅威亞砜、多菌靈、涕滅威砜、烯啶蟲胺、滅多威、噻蟲嗪、吡蚜酮、啶蟲脒、三環(huán)唑、噻蟲胺、氯噻啉、涕滅威、嘧霉胺、氯吡脲、甲拌磷亞砜、甲霜靈、甲拌磷砜、烯酰嗎啉、咪鮮胺、甲萘威、丙環(huán)唑、多效唑、三唑酮、啶酰菌胺、氟吡菌胺、戊唑醇、甲氧蟲酰肼、三唑磷、稻瘟靈、氯蟲苯甲酰胺、蟲酰肼、甲拌磷、茚蟲威、噠螨靈、丙溴磷、阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，1000mg·L-1(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心)。

1.2 主要儀器裝置

XevoTQS-micro液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(HSS T3 100×2.1mm，1.8μm，美國Waters公司)；EFAA-DC24-RT氮吹濃縮儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；TG16-WS離心機(jī)(湖南湘儀公司)；HX-PB1058勻漿機(jī)(AUX奧克斯)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將藍(lán)莓鮮果放入勻漿機(jī)中制成果漿，準(zhǔn)確稱取10.00g果漿樣品(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入0.1%甲酸的乙腈溶液20mL，15000r·min-1勻漿提取2min后，加入QuEChERS提取凈化包，振搖分散均勻，渦旋振蕩5min，于離心機(jī)中4000r·min-1離心5min，取上清液10mL，氮吹濃縮至近干，加入50%乙腈水溶液定容至1mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待分析。

1.3.2 基質(zhì)溶液制備

選擇不含待測目標(biāo)物的藍(lán)莓樣品按1.3.1樣品制備方法制備空白藍(lán)莓基質(zhì)溶液，備用。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取0.1mL各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，配制10mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用基質(zhì)溶液稀釋配制成濃度分別為50μg·L-1、100μg·L-1、250μg·L-1、500μg·L-1、1000μg·L-1和2500μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3,100×2.1mm,1.8μm；流動相A:0.1%甲酸水溶液；流動相B:含0.1%甲酸的乙腈溶液；按表1的程序進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5mL·min-1，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5μL。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜掃描條件

離子化方式：ESI(+)；質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～1000；質(zhì)譜采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式；噴霧電壓：3.5kV；離子源溫度：600℃；霧化氣：900L/Hr。40種農(nóng)藥保留時間、儀器分析參數(shù)詳見表3。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

利用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇、乙腈和0.1%甲酸乙腈3種不同的提取溶劑對藍(lán)莓樣品農(nóng)藥殘留測定的效率，評估其對提取效果的影響，篩選出最合適的溶劑。結(jié)果表明，采用0.1%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑，效果最佳，40種農(nóng)藥回收率在70%～120%，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～10%，滿足檢測的要求；用甲醇做提取溶劑時，效果最差，部分目標(biāo)檢測物回收率低于40%，同時重復(fù)性偏差大于20%；乙腈做提取溶劑回收率和重復(fù)性稍差。因此，選擇0.1%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑。

同時選擇不同體積的0.1%甲酸乙腈溶液作為提取劑，分別加入5mL、10mL、20mL、30mL提取溶劑進(jìn)行比對試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)提取劑的用量為5mL和10mL，部分目標(biāo)檢測物的回收率和重復(fù)性無法滿足要求；當(dāng)提取溶劑的用量增加到20mL，回收率明顯提高，且重現(xiàn)性指標(biāo)穩(wěn)定。用量提高到30mL，各指標(biāo)沒有明顯變化，但都滿足檢測要求，回收率在70%～120%，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差在1%～10%。綜合考慮提取效果和環(huán)保因素，最終選擇20mL的0.1甲酸乙腈溶液作為提取劑。

2.2 凈化條件的選擇

藍(lán)莓多種農(nóng)藥殘留分析的難點(diǎn)在于脂肪酸和色素含量高，基質(zhì)特別復(fù)雜，對目標(biāo)農(nóng)藥的檢測造成不利影響。對比市面上商品化的QuEChERS凈化包，最終選擇Waters4種不同配比的凈化包進(jìn)行比對試驗(yàn)，4種凈化包的吸附材料對比見表2。

表2 凈化包對比

通過對比這4種凈化包加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第4種凈化包效果最好，回收率達(dá)到78%～106%，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差均<6%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1200mg MgSO4加400mg PSA加400mg C18凈化包對樣品進(jìn)行凈化處理。

2.3 目標(biāo)檢測物質(zhì)譜條件的篩選

把本方法所檢測的40種農(nóng)藥都配制成100ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，利用儀器自帶的軟件程序，對每種目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行質(zhì)譜方法開發(fā)，通過對不同的離子對進(jìn)行比較，選擇響應(yīng)較大，穩(wěn)定性較好的一組離子對作為定量離子對；選擇響應(yīng)較大，具有特征的2組離子對作為定性離子，依次篩選出每種農(nóng)藥的最佳錐孔電壓和離子對的碰撞能量，具體的儀器參數(shù)信息及篩選出的離子對見表3，典型的幾種農(nóng)藥質(zhì)譜圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

用配制好的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣分析，以目標(biāo)檢測物濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程和相關(guān)系數(shù)，以信噪比S/N=3估算每種目標(biāo)檢測物的檢出限，再根據(jù)估算的結(jié)果配制相當(dāng)濃度的樣品進(jìn)行重復(fù)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限，結(jié)果也列于表3。從表3可以看出，藍(lán)莓中的40種農(nóng)藥都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r范圍在0.990～1.000，檢出限在0.01～2.33μg·kg-1。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

向藍(lán)莓陰性樣品中添加3個濃度10μg·kg-1、50μg·kg-1和100μg·kg-1的40種農(nóng)藥，按1.3.1的樣品制備方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平重復(fù)6次，同時做基質(zhì)空白和溶劑空白試驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各目標(biāo)檢測物的精密度和回收率。結(jié)果表明，40種農(nóng)藥回收率在72.6%～114.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.70%～7.24%。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文所建立的檢測方法具有非常好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足藍(lán)莓中多種農(nóng)藥殘留的檢測需求。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了藍(lán)莓中40種農(nóng)藥殘留同時檢測的方法。該方法簡單、快捷、靈敏度高，重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好。各農(nóng)藥組分濃度在10～100μg·kg-1，加標(biāo)回收率在72.6%～114.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.70%～7.24%，40種農(nóng)藥檢出限在0.01～2.33μg·kg-1。該方法適用于藍(lán)莓樣品的多農(nóng)藥殘留的日常檢測。此外，該方法對其它漿果類多農(nóng)藥殘留同時檢測具有較大的借鑒意義，非常值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。