劉永華，王秀君，閻 峰，許文元，付運星*

（1.漯河立蓓生物科技有限公司，河南 漯河 462300；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院；3.鄭州市農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法支隊）

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

試驗飼料黃粉蟲蛋白飼料購自鄭州立蓓有限公司；D-半乳糖購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol試劑均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購自天根生化科技有限公司。

1.2 試驗動物

75只30日齡的昆明小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（22±2）℃，濕度50%±10%，光照明暗各12 h，每日早8點晚6點投食換水，確保小鼠可以自由攝食和飲水，墊料每周更換兩次，保持衛(wèi)生狀態(tài)，防止因衛(wèi)生狀況出現(xiàn)疾病。

1.3 試驗分組

為防止小鼠出現(xiàn)應(yīng)激，在適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠3 d后，將75只昆明小鼠分為A、B、C、D、E五組。其中A組為對照組，B組為模型組，C、D、E組為試驗組，具體試驗方法見表1試驗小鼠的飼喂方案。分組后進行造模即每日對試驗組和模型組小鼠進行皮下注射濃度為0.15 g/ml的D-半乳糖溶液（生理鹽水溶解）0.05 ml，在造模一周時間后觀察小鼠無應(yīng)激反應(yīng)則加大D-半乳糖溶液注射量，由最初的每天每只0.05 ml每周遞加0.02 ml注射量，連續(xù)8周。

表1 試驗小鼠的飼喂方案

1.4 試驗設(shè)備與器材

試驗中使用到的設(shè)備與器材見表2。

表2 試驗中使用到的設(shè)備

1.5 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測方法

造模給藥后，取各組小鼠的腦、肝組織，提取腦、肝組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，試劑盒擴增，qPCR法檢測小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的mRNA相對表達水平，GAPDH為內(nèi)參。具體引物序列見表3。

表3 檢測基因所用引物序列

1.5.1 Trizol法提取RNA

Trizol是一種總RNA抽提試劑，含有異硫氰酸胍等物質(zhì)，能夠迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出核酸酶。

①剪取1 mg冰凍組織放入1.5 ml離心管并加入300 ul Trizol試劑靜置1h。

②使用研磨棒將組織研碎后加入100 ul氯仿和500 ul Trizol試劑后搖勻并靜置5 min后放入離心機離心，以徹底分離核蛋白復(fù)合體。離心機設(shè)定條件為12，000×g，15 minutes，4℃。

③吸取離心后的上清液400 ul加入1.5 ml離心管中后再加入400 ul異丙醇搖勻后放入離心機離心設(shè)定條件為12，000×g，15 minutes，4℃。注意全程轉(zhuǎn)移樣品時應(yīng)使用無RNA酶試驗器材。

④除去上清液留下離心管底部沉淀，加入1 000 ul濃度為75%乙醇（無RNA酶水配置）后放入冰箱-20℃保存。

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

①存有RNA的離心管離心（12，000×g，5 minutes，4℃）后除去上清液并靜置5 min使酒精揮發(fā)，再向其中加入無RNA酶水20～100 ul（視沉淀數(shù)量酌情添加），吹打混合均勻，要求一樣品一個槍頭，防止樣品污染。

②根據(jù)表格4配制反應(yīng)體系以除去樣品中的基因組DNA（gDNA）污染，混合均勻37℃孵育2 min，為預(yù)混樣1。

表4 預(yù)混樣1反應(yīng)體系

③根據(jù)表5配制反應(yīng)體系以進行RNA反轉(zhuǎn)錄，為預(yù)混樣2。之后將預(yù)混樣1和預(yù)混樣2進行混合。吹打混勻后進行水浴加熱。要求42℃加熱1 h接著80℃加熱10 min，-20℃保存。

表5 預(yù)混樣2反應(yīng)體系

1.5.3 熒光定量PCR步驟

①配制反應(yīng)液20 ul規(guī)格加入八聯(lián)管中，離心后放入ABI 7500 PCR儀器檢測。配制所需溶液如表6。

表6 檢測反應(yīng)體系

②ABI 7500 PCR儀器程序的設(shè)定，如表7。

表7 儀器程序的設(shè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 黃粉蟲蛋白對小鼠腦組織相關(guān)基因表達的影響

黃粉蟲蛋白對小鼠腦組織相關(guān)基因表達的影響結(jié)果見圖1，在檢測了各組小鼠腦組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因的mRNA表達水平后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除黃粉蟲蛋白低劑量組Nrf2、HO-1和黃粉蟲蛋白中劑量組HO-1 mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余黃粉蟲蛋白低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1的表達均上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 小鼠腦組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1基因表達量

2.2 黃粉蟲蛋白對小鼠肝組織相關(guān)基因表達的影響

黃粉蟲蛋白對小鼠肝組織相關(guān)基因表達的影響結(jié)果見圖2，在檢測了各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因的mRNA表達水平后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除黃粉蟲蛋白低劑量組HO-1、Nrf2、NQO1表達水平無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余黃粉蟲蛋白低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的表達均上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 小鼠肝組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1基因表達量

3 討論

氧化應(yīng)激指機體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）與抗氧化成分平衡發(fā)生崩壞后而引起的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。ROS是在正常的生理過程中產(chǎn)生的，如果在無外界刺激源的條件下，機體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除是處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)下的。但是如果機體內(nèi)的ROS含量相對升高而機體無法及時將其清除，這就會使得機體組織中的過氧化水平明顯升高引發(fā)一系列反應(yīng)后導(dǎo)致機體受到損害。肝、腦的氧化應(yīng)激是其發(fā)生損傷、發(fā)展為疾病的重要機制之一，因此，抑制氧化應(yīng)激就成為防止肝腦損傷、疾病發(fā)生的一個有效途徑。

在對抗氧化的研究中，人們普遍認(rèn)為最為重要的內(nèi)源性抗氧化通路之一就是Nrf2-ARE信號通路。其中Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因編碼的蛋白具有抗氧化、解毒和抗炎等廣泛的細胞保護作用。而ARE是一種能編碼啟動子區(qū)域的多種解毒酶和細胞保護蛋白基因的增強子序列。正常生理狀態(tài)下，Nrf2通過與ECH聯(lián)合蛋白1（Keap1）特異性結(jié)合于細胞質(zhì)中，此時Nrf2的活性受到抑制，Nrf2蛋白是處于低水平的，這是因為Keap1是一個Nrf2的E3泛素連接酶底物接頭，可導(dǎo)致蛋白酶體的快速降解。更重要的是，Keap1是含有高活性的半胱氨酸，一旦被活性氧（ROS）或其他親電試劑刺激時，就會阻止對Nrf2進行蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致Nrf2蛋白在氧化應(yīng)激下迅速積累，激活后的Nrf2進入細胞核，并與小肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物（s MAF）蛋白結(jié)合形成二聚體，并與順式作用元件ARE相結(jié)合，啟動下游抗氧化保護性基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，包括血紅素氧化酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）等。這些抗氧化物質(zhì)能夠保護機體和細胞免受ROS及一些毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物活性代謝產(chǎn)物等）的侵害。

在對試驗數(shù)據(jù)及試驗結(jié)果進行處理分析后，從圖1中的四組柱狀圖里組A對照組和組B模型組的基因表達量對比中可以得出結(jié)論：GAL誘導(dǎo)小鼠成功建立衰老模型。并且，在與模型組的對照中可見Nrf2、HO-1低濃度黃粉蟲蛋白組和HO-1中濃度黃粉蟲蛋白組表達量水平無明顯差異。由此結(jié)合四組柱狀圖及結(jié)果可得出：低濃度黃粉蟲蛋白組對于腦Nrf2、HO-1、NQO1基因表達無明顯積極影響，對GCLC基因表達卻有明顯的積極影響，中濃度黃粉蟲蛋白組對腦HO-1基因表達無明顯積極影響，對腦Nrf2、NQO1、GCLC基因表達卻有著較為明顯的積極影響。高濃度黃粉蟲蛋白組則對腦Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC基因表達均有著明顯的積極作用，其基因表達量均較大幅上調(diào)。

同理，在對試驗數(shù)據(jù)及試驗結(jié)果進行處理分析后，從圖2中的四組柱狀圖里組A對照組和組B模型組的基因表達量對比中可以得出結(jié)論：GAL誘導(dǎo)小鼠成功建立衰老模型。并且，在與模型組的對照中可見Nrf2、HO-1低濃度黃粉蟲蛋白組和HO-1中濃度黃粉蟲蛋白組表達量水平無明顯差異。由此結(jié)合四組柱狀圖及結(jié)果可得出：低濃度黃粉蟲蛋白組對于腦Nrf2、HO-1、NQO1基因表達無明顯積極影響，對GCLC基因表達卻有明顯的積極影響，中濃度黃粉蟲蛋白組和高濃度黃粉蟲蛋白組則對腦Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC基因表達均有著明顯的積極作用，其基因表達量均較大幅上調(diào)。

4 結(jié)論

該試驗結(jié)果說明，一定濃度的黃粉蟲蛋白或許能提高Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC基因表達量，從而緩解、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示黃粉蟲蛋白可能是通過激活Nrf2-ARE信號通路來緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠的肝、腦衰老受損，可能為臨床黃粉蟲蛋白應(yīng)用于緩解慢性肝腦損傷提供理論依據(jù)?！?/p>