石 馨,惠 明,田 青,黃繼紅

(河南工業(yè)大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001)

酯酶(E.C.3.1.1.1)是催化酯鍵合成和水解的一類酶的總稱[1],廣泛存在于動物、植物和微生物中,其中微生物源的酯酶在工業(yè)生產(chǎn)中應用最多[2-3]。已有研究證明:酵母[4-5]、霉菌[6]和細菌[7]均可產(chǎn)生酯化酶,在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生豐富的酯類風味物質(zhì)[8-12],比如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等,均能呈現(xiàn)出不同的風味,這些酯類對發(fā)酵產(chǎn)品的感官指標有較大的影響,并且酯類物質(zhì)都屬于白酒風味的重要貢獻物質(zhì)。因此,酯化酶廣泛應用于白酒工業(yè),為白酒提酯增香[13-14],改善普通白酒酯香味不足的質(zhì)量缺陷[15-19]。異常威客漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)酯類、醇類和有機酸類等風味物質(zhì),對香氣的形成起著重要作用,常常作為白酒釀造、發(fā)酵食品的重要功能微生物。筆者以實驗室保藏的異常威客漢姆酵母Y-1為出發(fā)菌株,通過響應面法對其發(fā)酵產(chǎn)酯酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化,確定適宜的培養(yǎng)基組分,用以提高Y-1菌所產(chǎn)酯酶的活力,并采用固相微萃取法(SPME)對其發(fā)酵液揮發(fā)性成分進行提取,結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)對其進行定量分析,研究Y-1菌的產(chǎn)酯風味成分,為其推廣應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌 種

異常威客漢姆酵母Y-1,本實驗室分離及保藏。

1.1.2 主要試劑

乙腈、對硝基苯酚乙酸酯,上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基,購自瑞楚生物公司。

液體產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.2 g/L,KH2PO40.2 g/L,MgSO40.2 g/L,CaCl20.2 g/L。

1.2 儀器與設備

電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2450紫外可見分光光度計、QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀,日本島津有限公司;固相微萃取裝置(SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭),江蘇默克儀器有限公司;ZHJH-C1112C超凈工作臺、ZQZY-CS全溫恒溫培養(yǎng)搖床、ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,再將菌液稀釋涂布于YPD固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,相同培養(yǎng)條件下活化2次,將活化后的菌體接至斜面PDA培養(yǎng)基,于4 ℃冰箱保藏。產(chǎn)酯發(fā)酵時,將種子液按體積分數(shù)8%的接種量接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件與菌種活化時一致。

1.3.2 生長曲線的測定

挑取兩環(huán)活化好的菌體,接入YPD液體培養(yǎng)基中,以溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)22 h,每2 h測1次600 nm處的吸光度OD,以培養(yǎng)時間為橫坐標,OD600為縱坐標,繪制菌株生長曲線。

1.3.3 酯酶活力測定

酯酶活力測定方法參考文獻[20]的方法。

1.3.4 單因素實驗

分別以玉米淀粉、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖作為碳源,質(zhì)量濃度均為10 g/L,同時保證培養(yǎng)基其余組分不變。裝液量為100 mL∶250 mL,接種量按體積分數(shù)8%接種,溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測定酯酶活力。

分別以酵母浸粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3和KNO3作為氮源,質(zhì)量濃度均為20 g/L,同時保證培養(yǎng)基其余組分不變。裝液量為100 mL∶250 mL,接種量按體積分數(shù)8%接種,溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測定酯酶活力。

1.3.5 Box-Behnken實驗設計

利用Design-Expert 8.0軟件創(chuàng)建Box-Behnken實驗設計。通過單因素實驗可知:影響較大的3個因素為酵母膏、NH4Cl和玉米淀粉,以酯酶活力作為響應值,記為變量Y。根據(jù)初始培養(yǎng)基的產(chǎn)酯酶結(jié)果,設計了3因素3水平的響應面實驗設計,因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnke實驗設計因素水平

1.3.6 香氣物質(zhì)分析

按照1.3.1的方法進行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后8 000 r/min離心5 min,取上清液,即為發(fā)酵液。精確量取8 mL發(fā)酵液,緩慢加入到20 mL的頂空瓶中,倒入時樣品不得沾到瓶壁,以免萃取頭沾到樣品,對結(jié)果產(chǎn)生影響。加入1 μL的內(nèi)標物(2%乙酸正丁酯),再倒入1 g的NaCl,立刻將樣品瓶密封壓緊。NaCl的加入能夠促進香氣成分揮發(fā),在同樣的處理條件下,加入NaCl的樣品可檢出物質(zhì)種類明顯增加,并且檢出同一物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)增大,能夠最大程度地全部檢出;萃取溫度選擇45 ℃,溫度過低,會導致檢測出的物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)偏低,溫度過高,可增強物質(zhì)的揮發(fā)能力,同時解吸能力也增大,也會使檢測物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)變小。萃取之前,先將頂空瓶置于45 ℃水浴中平衡10 min,平衡結(jié)束之后萃取50 min。詳細萃取方法以及氣相色譜、質(zhì)譜條件參考文獻[21]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線繪制

所測得的異常威客漢姆酵母菌生長曲線如圖1所示。由圖1可知:在0～2 h,菌液濃度緩慢上升,屬于新環(huán)境的適應階段,為遲滯期;在2～8 h,菌液濃度加速升高,為快速生長期,此時期以最快的速度進行繁殖;8 h后隨著時間的增長,吸光度值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢,這時培養(yǎng)體系中缺乏了菌體生長所需的養(yǎng)分,菌體逐漸減小直至死亡,故在8～20 h的前段為穩(wěn)定期,后段為衰退期。因此,在相同培養(yǎng)條件下制備種子液,培養(yǎng)至10 h左右即可滿足實驗要求。

圖1 異常威客漢姆酵母Y-1生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae Y-1

2.2 單因素實驗

碳源通過微生物代謝作用為微生物整個生長過程提供能量[22],碳源的不同種類對微生物酶的產(chǎn)生具有直接影響;同時,微生物因其可以將碳源轉(zhuǎn)化成自身的細胞組成成分,所以微生物的生長對碳源也具有選擇性,即二者之間存在雙向選擇的關(guān)系[23]。在實驗中,共探究了4種不同碳源對產(chǎn)酯酶的影響,其結(jié)果如圖2所示,當酯酶活力最高時,碳源為玉米淀粉,以葡萄糖作為碳源時酯酶活力相對較低,說明碳源的種類對菌株產(chǎn)酯酶活力具有一定影響,因此選取玉米淀粉為固定碳源。實驗以玉米淀粉為固定碳源,考察不同有機氮源和無機碳源對產(chǎn)酯酶活力的影響微生物細胞中的含氮物質(zhì)通常利用氮源物質(zhì)來合成,僅有少數(shù)情況下也會被作為能源物質(zhì),微生物對碳源的利用同樣具有選擇性。結(jié)果表明:有機氮源對發(fā)酵產(chǎn)酯酶活力的影響程度與碳源的影響程度相差不大,但是無機氮源對產(chǎn)酯酶活力的影響較大,實驗以氯離子最為明顯,與楊曉曦等[24]所研究的含有氯離子的無機氮源可以促進產(chǎn)酶的結(jié)果一致。

圖2 不同碳源、氮源對產(chǎn)酯酶活力的影響Fig.2 Effects of carbon source on producing esterase activities

2.3 Box-Behnke設計與分析

用Design-Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設計方法,選取了3個對酯酶活性有明顯影響的因素,在3個水平下對酯酶活力的影響作進一步研究和探討,以獲得其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,共17個實驗點,實驗設計及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnke實驗設計因素水平及響應值

利用Design-Expert 8.0軟件,以異常威客漢姆酵母Y-1菌株所產(chǎn)酯酶活力(U/mL)為響應值,A(酵母膏質(zhì)量分數(shù))、B(NH4Cl質(zhì)量分數(shù))、C(玉米淀粉質(zhì)量分數(shù))為自變量,擬合得到回歸方程為

Y=0.25+0.022A-3.694B+0.063C-

6.694AB-0.020AC+5.387BC+

2.258A2-0.062B2-0.037C2

對回歸模型進行顯著性分析,得到顯著性檢驗結(jié)果如表3所示。由表3可以看出:本實驗所選的模型回歸方程P<0.01,F=12.41。回歸方程的顯著性一般通過F值來反映,對應P值越小,說明相應變量的顯著性就越高,所以此回歸模型顯著;模型中的一次項A,C和二次項B2對響應值的影響達到極顯著水平(P<0.01),二次項C2達到顯著水平(P<0.05)。失擬項(Lack of fit)代表模擬函數(shù)與真實函數(shù)之間的差異,差異越小意味著效果越好,一般通過P值的顯著性來判斷,P值越大,說明擬合的模型方程效果越好。表3顯示:本實驗模型的失擬項P=0.300 4,其P>0.05,不顯著,說明該方程對實驗擬合較好,與真實實驗不存在分歧,該模型可用于本實驗條件下的培養(yǎng)基組分優(yōu)化。根據(jù)軟件計算結(jié)果,可得各因素對應的實驗值分別為A=1,B=0.02,C=0.29,此時響應值Y為最大值,Ymax=0.275 U/mL。由回歸方程方差結(jié)果可知:決定系數(shù)為0.941,調(diào)整決定系數(shù)為0.865 2,說明模型解釋了響應變量中大約14%的變異,說明該方程對實驗結(jié)果擬合度較高,可以應用于實際實驗中的分析。

表3 回歸方程顯著性分析

2.4 響應面優(yōu)化及驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件得到多元二次回歸方程所代表的響應曲面及等高線圖如圖3～5所示,通過圖形可以直觀反映出3個因素之間相互作用的影響程度。響應面中的曲線彎曲程度不同則代表因素對結(jié)果的影響不同,越彎曲則說明研究因素對結(jié)果影響越大;等高線越趨近于橢圓,則說明研究因素的交互作用對于響應值作用顯著,呈圓形則說明交互作用不顯著,顏色過渡變化的越快表明坡度越大,對結(jié)果影響越顯著[25]。經(jīng)軟件分析,單個因素對酯酶活力的影響比交互項的影響顯著。由圖3可知:隨NH4Cl質(zhì)量的增加,酯酶活力逐漸降低,隨酵母膏的增多,酯酶活力逐漸增高。由圖4可知:玉米淀粉和酵母膏對酯酶活力的影響均隨每個因素增大,增加到最大值后再逐漸減小。由圖5可知:隨玉米淀粉的量增加,酯酶活力有所提高,隨NH4Cl增加,酯酶活力先提高后再下降。

圖3 酵母膏和NH4Cl質(zhì)量分數(shù)對酶活力的交互影響Fig.3 The interactive influence of yeast extract and NH4Cl mass fraction on enzyme activity

圖4 酵母膏和玉米淀粉質(zhì)量分數(shù)對酶活力的交互影響Fig.4 The interactive influence of the content of yeast extract and corn starch on enzyme activity

圖5 NH4Cl和玉米淀粉質(zhì)量分數(shù)對酶活力的交互作用影響Fig.5 The interactive Effect of NH4Cl and corn starch content on enzyme activity

為了驗證該模型預測的準確性和適用性,按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):酵母膏10 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,玉米淀粉2.9 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.1 g/L,KH2PO40.1 g/L,MgSO40.1 g/L,CaCl20.1 g/L,在此條件下進行實驗,所得結(jié)果為0.263 U/mL,驗證值與模型預測值0.275接近,說明該模型可以較好地預測實驗結(jié)果,運用響應面實驗優(yōu)化異常威客漢姆酵母Y-1產(chǎn)酯酶的發(fā)酵培養(yǎng)基是可行的,并有較好的適用性。

2.5 香氣物質(zhì)的分析

2.5.1 發(fā)酵液中揮發(fā)性組分總體分析

發(fā)酵液揮發(fā)性組分固相微萃取后,經(jīng)GC-MS分析,總離子流色譜圖如圖6所示,與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對,并結(jié)合保留時間對待測樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進行定性,共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì)。發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)種類包括酯類、酸類、烷類和其他類(酚類、酮類和苯等),但不同類型揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量區(qū)別較大。發(fā)酵液中所含酯類、烷類較多,分別有17,7種,其相對質(zhì)量分數(shù)分別為86.23%,2.44%;酸類種類較少,有5種,其相對質(zhì)量分數(shù)為2.47%;其他物質(zhì)種類共有12種,相對質(zhì)量分數(shù)為8.86%。

圖6 揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.6 Total ion chromatography of GC-MS of the volatile components

2.5.2 發(fā)酵液中酯類物質(zhì)鑒定結(jié)果分析

白酒釀造過程中的酯類物質(zhì)是由酸和醇酯化作用形成,主要形成途徑有白酒發(fā)酵過程中相關(guān)微生物的代謝反應生成;白酒發(fā)酵過程中添加的大曲及糖化劑催化形成相應酯類物質(zhì);通過單純的有機反應合成酯[28]。這些脂類大多數(shù)會呈現(xiàn)花香及果香,是白酒中的主要呈香物質(zhì)[29]。經(jīng)分析得到發(fā)酵液中的主要酯類(0.1%以上),物質(zhì)種類及相對質(zhì)量分數(shù)如表4所示。其中己酸乙酯質(zhì)量分數(shù)最高(除內(nèi)標液乙酸正丁酯),占10.345%,可能為該菌株的特征性酯類物質(zhì),其次質(zhì)量分數(shù)較高的分別是乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯和戊酸乙酯,相對質(zhì)量分數(shù)分別為1.719%,1.216%,0.343%,不同的酯類物質(zhì)有著不同的香氣,構(gòu)成了白酒的不同風味特征。比如己酸乙酯,具有強烈的果香;辛酸乙酯,有一定的白蘭地酒香;庚酸乙酯,有菠蘿香氣。

表4 主要酯類成分相對質(zhì)量分數(shù)表

3 結(jié) 論

通過單因素試驗確定了適宜異常威客漢姆酵母Y-1生長的最適碳源、氮源,然后設計響應面優(yōu)化實驗對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化,最終得到了菌株Y-1的培養(yǎng)基組分,確定了各組分的最佳添加量,并在此組分下驗證實驗,酯酶活力達到0.263 U/mL,是優(yōu)化前的4.3倍,且與預測值0.275接近,說明該模型具有較好的適用性;利用固相微萃取以及氣質(zhì)聯(lián)用儀對該培養(yǎng)組分下菌株Y-1發(fā)酵液揮發(fā)性成分進行提取并分析,共檢測出17種酯類物質(zhì),其相對質(zhì)量分數(shù)占總揮發(fā)成分的86.23%。通過微生物產(chǎn)酯化酶來改善白酒品質(zhì)是提升我國白酒質(zhì)量的一個研究方向,同時也為酯酶的開發(fā)和應用提供了理論參考。