李學(xué)朋,陳曉妮,劉 超,張培鑫,徐 娜,周 敬

(1.內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物發(fā)酵節(jié)能環(huán)保技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

黃原膠生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物豆渣,具有水分大、不耐儲(chǔ)藏和運(yùn)輸成本高等特性,造成豆渣的利用率低,只可作為飼料進(jìn)行出售,產(chǎn)品的附加值低。近年來,隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的重視及檢測(cè)水平的提高,對(duì)豆渣的研究不斷深入,對(duì)豆渣的認(rèn)識(shí)更加清楚,對(duì)豆渣的再利用也有了新的方法。目前,豆渣再利用研究主要集中在豆渣食品方向,如將豆渣添加到面制食品中,可以改善面制食品的口感,豆渣中的大豆膳食纖維提取后,可以生產(chǎn)膨化食品。研究發(fā)現(xiàn):作為副產(chǎn)物的豆渣中仍含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、膳食纖維、碳水化合物和維生素等,將豆渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行再利用,既可以減少生產(chǎn)成本,又可以降低對(duì)環(huán)境的影響。酶法提取大豆蛋白條件最為溫和[1-4],對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的破壞性小,又有利于產(chǎn)物在發(fā)酵中的再次應(yīng)用,因此本實(shí)驗(yàn)旨在回收豆渣中的大豆蛋白,并回用于黃原膠發(fā)酵[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

副產(chǎn)物,由內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司黃原膠車間生產(chǎn);黃原膠發(fā)酵原料淀粉乳,由內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司提供;發(fā)酵用黃豆、碳酸鈣、硫酸鎂以及磷酸氫二鉀,由車間生產(chǎn)采購(gòu)普通市售產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氫氧化鈉(分析純)、硫酸(分析純)、凱氏定氮催化劑,堿性蛋白酶食品級(jí)200 kU/g高活力酶制劑,纖維素酶食品級(jí)200 kU/g高活力酶制劑。

1.1.3 儀器與設(shè)備

K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀,海能未來技術(shù)集團(tuán)股份有限公司;METTLER TOLEDO ME204E分析天平;100 L全自動(dòng)發(fā)酵罐,上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司。

1.2 豆渣實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白的提取方法

黃豆作為黃原膠發(fā)酵的主要氮源,經(jīng)過粉碎、過篩,加水105 ℃水解30 min后的產(chǎn)物應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵,而過篩產(chǎn)生的豆渣為本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)原料。豆渣和水按照適當(dāng)比例在酶解罐中混勻,攪拌速度以確保豆渣不沉淀即可。用40 ℃左右溫水溶解酶制劑,利用蒸汽保持豆渣混懸液溫度穩(wěn)定在40～60 ℃進(jìn)行酶解。酶解后通過檢測(cè)清液含氮量計(jì)算蛋白回收率,并將回收的酶解豆渣清液應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵。

1.2.2 蛋白的回收率

將酶解后的豆渣混懸液過濾,去除豆渣顆粒,得到酶解豆渣清液。準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確值±0.000 2 g)酶解豆渣清液至凱氏定氮儀配套消化管中,加入凱氏定氮催化劑,及濃硫酸6 mL,400 ℃消解1.5 h,降至室溫后使用凱氏定氮儀進(jìn)行含氮量(質(zhì)量濃度下同)檢測(cè)。用同樣的方法對(duì)酶解前的豆渣混懸液進(jìn)行含氮量檢測(cè),注意取樣時(shí)保證豆渣混懸液樣品均勻性[8-11]。豆渣蛋白收率計(jì)算式為

1.2.3 豆渣的料液比

取黃原膠車間生產(chǎn)過程產(chǎn)生的豆渣,按m(豆渣)∶m(水)分別為1∶3,3∶7,7∶13,2∶3的料液比加入自來水中制備1 L料液,按照10%的復(fù)合酶添加量(過量的酶),溫度50 ℃,酶解6 h。待料液降溫后,用60目濾布過濾,并檢測(cè)清液含氮量,計(jì)算豆渣蛋白收率。

1.2.4 酶解條件的單因素

復(fù)合酶加入量:在豆渣混懸液實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和20 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶(按質(zhì)量比1∶1混合)作為水解酶,復(fù)合酶添加量分別按照0.5%,0.7%,1%,3%,5%,7%,9%的質(zhì)量比添加混勻后,50 ℃水浴攪拌加熱6 h。用60目濾布過濾,并檢測(cè)清液含氮量,計(jì)算豆渣蛋白收率。

酶解時(shí)間:在豆渣混懸液實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和200 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶作為水解酶,按照復(fù)合酶的添加量10%(過量的酶),酶解時(shí)間分別為2,3,4,5,6,7,9 h,50 ℃水浴攪拌加熱。用60目濾布過濾,并檢測(cè)清液含氮量,計(jì)算豆渣蛋白收率。

酶解溫度:在豆渣混懸液實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和200 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶作為水解酶,按照復(fù)合酶的添加量10%(過量的酶),酶解溫度分別為30,35,40,45,50,55,60 ℃,水浴攪拌加熱6 h。用60目濾布過濾,并檢測(cè)清液含氮量,計(jì)算豆渣蛋白收率。

1.2.5 酶解條件的優(yōu)化

為了優(yōu)化復(fù)合酶的水解工藝條件,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇加酶量A、酶解時(shí)間B和酶解溫度C這3因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),以確定復(fù)合酶水解的最佳工藝條件[12-14]。因素及水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)

1.2.6 大豆蛋白回收率的檢測(cè)

取酶解前的豆渣混懸液或酶解后的豆渣清液0.1 g放入消化管中,加入12 mL硫酸后于石墨消解爐上消解2 h,待消化液冷卻后利用凱氏定氮儀檢測(cè)含氮量,并計(jì)算大豆蛋白回收率。

1.3 酶解豆渣回用于黃原膠發(fā)酵

1.3.1 菌種與原料

菌種為野油菜黃單胞桿菌,由黃原膠車間提供。

1.3.2 黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基:質(zhì)量濃度分別為蔗糖10 g/L,蛋白胨8 g/L,酵母粉1 g/L,牛肉浸膏3 g/L;pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:質(zhì)量濃度分別為大豆水解液5 g/L,玉米淀粉50 g/L,磷酸二氫鉀5 g/L,碳酸鈣3 g/L,硫酸鎂2.5 g/L,檸檬酸0.25 g/L,硫酸亞鐵0.25 g/L。根據(jù)大豆水解液含氮量,添加不同比例的豆渣回收大豆蛋白,進(jìn)行黃原膠發(fā)酵?；厥沾蠖沟鞍渍嫉吹谋壤謩e設(shè)定為0,10%,20%,30%,50%。

種子培養(yǎng):利用120 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行菌種培養(yǎng),根據(jù)種子培養(yǎng)基配方配置料液,定容50 L,121 ℃恒溫滅菌30 min后接種,溫度31 ℃,pH 7.0,轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)22 h左右,至OD600值凈增10以上。

發(fā)酵控制:利用100 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行菌種發(fā)酵培養(yǎng),根據(jù)種子培養(yǎng)基配方配制料液,定容40 L,121 ℃恒溫滅菌30 min,接種量5%,溫度32 ℃,pH 7.0,轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)72 h[15-21]。

1.3.3 產(chǎn)品測(cè)定方法

黃原膠產(chǎn)量測(cè)定:100 g發(fā)酵液中加入2% KCl和2倍體積9%乙醇沉淀黃原膠,取沉淀物60 ℃烘干至恒重。

發(fā)酵液黏度測(cè)定:用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì),室溫,4號(hào)轉(zhuǎn)子,30 r/min下測(cè)定。

淀粉乳轉(zhuǎn)化率:淀粉乳轉(zhuǎn)化率=黃原膠產(chǎn)率/淀粉乳添加量。

黃原膠成品流變性檢測(cè):取水250 mL,置燒杯中,調(diào)節(jié)低螺距型攪拌器或磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為800 r/min,邊攪拌變緩緩加入本品(按干燥品計(jì))和混合物各3 g,繼續(xù)攪拌10 min,邊攪拌邊用水44 mL沖洗燒杯杯壁,停止攪拌,快速振搖燒杯,使燒杯上的顆粒完全浸入溶液中,調(diào)節(jié)溫度至(25±1) ℃。繼續(xù)以轉(zhuǎn)速為800 r/min攪拌2 h(攪拌過程中可適當(dāng)旋搖燒杯,以避免樣品分層,每次旋搖時(shí)間控制在30 s內(nèi),如供試品難以混合均勻,可適當(dāng)延長(zhǎng)攪拌時(shí)間),作為供試品溶液。取供試品溶液適量,置桶內(nèi)直徑為25 mm,外筒直徑為27 mm的同軸圓筒旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)中,內(nèi)筒浸入樣品的深度為42 mm,以轉(zhuǎn)速為18 r/min或角速度為1.885 rad/s(或選擇適宜的測(cè)試條件,使剪切速率為24 s-1)依法測(cè)定(《中國(guó)藥典》2020年版通則0633第三法),在溫度為25 ℃時(shí)的動(dòng)力黏度應(yīng)不小于0.6 Pa·s。

2 結(jié)果與分析

2.1 料 液 比

料液比對(duì)蛋白回收率的影響如圖1所示。料液比對(duì)豆渣在溶液中的狀態(tài)有影響,在一定程度上影響豆渣與酶的接觸面積。選擇m(豆渣)∶m(水)分別為1∶3,3∶7,7∶13,2∶3的料液比加入自來水及過量的酶,由圖1可以看出:蛋白回收率在一定范圍內(nèi),會(huì)隨著料液比的增加而增加;當(dāng)料液比大于7∶13時(shí),蛋白回收率隨著料液比的增加而下降,故實(shí)驗(yàn)選擇料液比為7∶13。

圖1 料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of material/liquid ratio on protein yield

2.2 酶解條件

2.2.1 酶加入量

確定照料液比7∶13為最佳料液比后,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和200 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶作為水解酶,酶添加量分別按照0.5%,0.7%,1%,3%,4%,5%,7%,9%的比例添加混勻,加酶量對(duì)蛋白回收率的影響如圖2所示。由圖2可以看出:隨著酶添加量的提高,蛋白回收率也提高;當(dāng)酶的添加量大于4%時(shí),蛋白回收率增加不明顯。

圖2 加酶量對(duì)蛋白回收率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on protein yield

2.2.2 酶解時(shí)間

按料液比7∶13,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和200 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶作為水解酶,按照酶的添加量7%,酶解時(shí)間對(duì)蛋白回收率的影響如圖3所示。由圖3可以看出:隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白回收率也提高;當(dāng)酶解時(shí)間大于5 h以后,蛋白回收率增加不明顯。這是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行,底物與酶的有效接觸逐漸減少,且產(chǎn)物的生成一定程度上抑制了反應(yīng)的進(jìn)行,故確定酶解時(shí)間為5 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白回收率的影響Fig.3 Effect oftime on protein yield

2.2.3 酶解溫度

按料液比7∶13,以200 kU/g的堿性蛋白酶食品級(jí)和200 kU/g的纖維素酶食品級(jí)復(fù)合酶作為水解酶,按照酶的添加量7%,酶解溫度分別為30,35,40,45,50,55,60 ℃,酶解溫度對(duì)蛋白回收率的影響如圖4所示。由圖4可以看出:溫度低于55 ℃隨著酶解溫度的提高,蛋白回收率也提高;當(dāng)酶解溫度大于55 ℃,蛋白回收率明顯下降。

圖4 酶解溫度對(duì)蛋白回收率的影響Fig.4 Effect oftemperature on protein yield

2.2.4 酶解法正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn),選擇加酶量分別為3%,4%,5%,酶解時(shí)間分別為5,6,7 h,酶解溫度分別為45,50,55 ℃進(jìn)行3因素L9(34)正交實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如表2所示,確定復(fù)合酶水解的最佳工藝條件。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知:在影響豆渣蛋白回收率的因素中,3個(gè)因素的影響A>B>C,即復(fù)合酶添加量的影響最大,其次是酶解時(shí)間,最后是酶解溫度。酶解豆渣的最佳條件為復(fù)合酶添加量為底物的4%,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間5 h。在正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按此條件進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到的蛋白回收率均在93%以上,證明酶解反應(yīng)較穩(wěn)定。

2.3 酶解豆渣回用黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

酶解豆渣回用黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知:酶解豆渣回用黃原膠發(fā)酵[22-27]對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)膠、轉(zhuǎn)化率、流變性和白度等指標(biāo)影響不大,卻提高了黃原膠的黏度(CP),因此酶解豆渣應(yīng)用于黃原膠發(fā)酵是完全可行的。

表3 酶解豆渣回用黃原膠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

豆渣作為黃原膠發(fā)酵的副產(chǎn)物,仍含有大量未被利用的氮源,單純作為飼料產(chǎn)品的附加值較低,利用酶解技術(shù)將豆渣作為氮源用于生產(chǎn),降低了黃豆使用量,有效地降低生產(chǎn)了成本,且酶解后豆渣作為小分子多肽,更易被利用,有效提高了氮源的利用率。通過利用酶解豆渣進(jìn)行黃原膠發(fā)酵對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)膠、轉(zhuǎn)化率、流變性和白度等指標(biāo)無影響,卻可以顯著地提高黃原膠的黏度,酶解豆渣應(yīng)用至黃原膠發(fā)酵為有效提高黃豆利用率研究提出了新的思路。