王旭，馬素亞，周夢(mèng)玲，李晨萌，魏明清，倪敬年，李婷，田金洲，時(shí)晶

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腦病三科，北京 100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種復(fù)雜、進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病[1]，表現(xiàn)為以記憶力減退為主的多領(lǐng)域認(rèn)知功能損害[2]。全世界超過(guò)5 000萬(wàn)人患有AD[3]，占所有癡呆病例的60%～80%[4]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)假說(shuō)包括β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)假說(shuō)、Tau蛋白假說(shuō)、神經(jīng)免疫假說(shuō)、氧化應(yīng)激假說(shuō)等[5-6]。近年研究表明，許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制可能與腸道菌群有關(guān)。胃腸道的共生菌群可通過(guò)腸-腦軸調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫[7]，有研究者在AD大腦中觀察到抗炎細(xì)菌菌群的減少和促炎細(xì)菌菌群的增多[8]。同時(shí)，腸道菌群還可能通過(guò)觸發(fā)代謝性疾病引起癡呆，研究表明，糖尿病和肥胖等代謝性疾病會(huì)增加AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而腸道菌群的代謝改變可引起機(jī)體的代謝異常[9]。因此，進(jìn)一步了解腸道微生物的多樣性，分析其與AD發(fā)生的關(guān)聯(lián)性，對(duì)有關(guān)AD的臨床危險(xiǎn)因素和發(fā)病機(jī)制的研究具有推動(dòng)作用，可為尋找有效干預(yù)手段提供一定參考[10]。本研究旨在探討AD患者腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2019年5月北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腦病三科門診、病房及社區(qū)招募的61例受試者作為研究對(duì)象，年齡52～91歲；根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組(21例)、遺忘型輕度認(rèn)知損害(amnestic mild cognitive impairment，aMCI)組(20例)、AD組(20例)。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) NC組采用美國(guó)梅奧診所認(rèn)知正常診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：①無(wú)記憶減退或其他認(rèn)知損害主訴，或有不穩(wěn)定的輕微記憶減退；②無(wú)記憶損害客觀證據(jù)；③無(wú)活躍的神經(jīng)或精神疾病及其他可能影響認(rèn)知功能的疾病；④未使用精神藥物；⑤簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表(mini-mental state examination，MMSE)得分大學(xué)>26分、中學(xué)>24分、小學(xué)>23分、文盲>22分[12]；⑥臨床癡呆評(píng)定量表(clinical dementia rating，CDR)評(píng)分為0分[13]。

aMCI組采用歐洲阿爾茨海默病協(xié)會(huì)的輕度認(rèn)知損害診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：①受試者或其照料者有認(rèn)知功能下降主訴；②客觀的記憶障礙，延遲故事回憶(delayed story recall，DSR)量表評(píng)分<12.5分；③總體認(rèn)知功能正常，MMSE得分大學(xué)>26分、中學(xué)>24分、小學(xué)>23分、文盲>22分[12]；④臨床評(píng)估證實(shí)存在認(rèn)知障礙；⑤CDR評(píng)分為0.5分，記憶領(lǐng)域評(píng)分為0.5分；⑥日常生活能力正常或僅有輕微損害；⑦無(wú)癡呆，不符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)語(yǔ)言障礙卒中研究所和AD及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)的AD標(biāo)準(zhǔn)[15]；⑧Hachinski缺血量表評(píng)分≤4分[16]；⑨漢密爾頓抑郁量表評(píng)分<12分[17]；⑩沒(méi)有內(nèi)側(cè)顳葉萎縮(包括海馬體積萎縮)。

AD組采用國(guó)家衰老研究所-美國(guó)阿爾茨海默病學(xué)會(huì)[2]很可能的AD癡呆核心臨床標(biāo)準(zhǔn)：①起病隱匿，認(rèn)知功能逐漸惡化達(dá)數(shù)月或數(shù)年；②情景記憶和至少一個(gè)其他認(rèn)知領(lǐng)域的顯著損害；③MMSE得分大學(xué)≤26分、中學(xué)≤24分、小學(xué)≤23、文盲≤22分[12]；④日常生活能力受損[日常生活能力量表(activities of daily living scale，ADL)評(píng)分≥16分][18]；⑤Hachinski缺血量表評(píng)分≤4分；⑥內(nèi)側(cè)顳葉萎縮；⑦有足夠的聽(tīng)力和視力配合臨床研究，有一定的文化程度，既往能夠閱讀簡(jiǎn)單的文章和書寫簡(jiǎn)單的句子。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①其他神經(jīng)變性疾病，包括帕金森病、血管性癡呆、亨廷頓病、正常壓力腦積水、腦腫瘤、進(jìn)行性核上性麻痹、癲癇、慢性硬膜下血腫及多發(fā)性硬化；②有嚴(yán)重頭腦外傷史伴有持續(xù)神經(jīng)功能缺損或已知的腦結(jié)構(gòu)異常；③嚴(yán)重的腦血管疾病及肝臟、腎臟、肺部、代謝性或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(如甲狀腺功能異常)；④抑郁狀態(tài)(漢密爾頓抑郁量表評(píng)分≥12分)，或其他精神障礙；⑤有顯著的維生素B12或葉酸缺乏；⑥有癲癇病史或嚴(yán)重的藥物或乙醇濫用病史；⑦1個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗生素；⑧1個(gè)內(nèi)服用過(guò)胃腸動(dòng)力藥、瀉藥或其他影響胃腸動(dòng)力的藥物；⑨1個(gè)內(nèi)服用過(guò)益生菌等影響腸道菌群的藥物；⑩有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損以至于不能完成相關(guān)檢查，如便利手偏癱、各種失語(yǔ)、視聽(tīng)障礙等。

1.2方法 采用MMSE評(píng)估受試者總體認(rèn)知功能，CDR評(píng)定認(rèn)知損害的程度，ADL評(píng)估日常生活能力，DSR評(píng)估情景記憶。

對(duì)所有受試者進(jìn)行培訓(xùn)，指導(dǎo)其按照同樣的步驟使用一次性便盒采集糞便樣品約10 g，迅速置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏，并于24 h內(nèi)將樣品置于-80 ℃冰箱保存。采用TIANamp糞便提取試劑盒(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)提取糞便中菌群的DNA，用于16S核糖體RNA高通量測(cè)序。對(duì)獲得的DNA進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢合格后，用16S特定引物對(duì)特異可變區(qū)V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。使用Illuminam MiSeq平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌16S核糖體RNA高通量測(cè)序。得到有效序列數(shù)據(jù)后，使用Mothur v1.34.4在97%相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)歸類。根據(jù)OTU歸類結(jié)果對(duì)細(xì)菌物種間的親緣關(guān)系和物種間的差異進(jìn)行分析，獲得細(xì)菌分類和細(xì)菌相對(duì)豐度。

2 結(jié) 果

2.13組一般資料比較 3組受試者的性別、年齡、受教育年限、體質(zhì)指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組受試者的一般資料比較

2.23組認(rèn)知功能比較 3組受試者的MMSE、DSR、ADL、CDR評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，AD組的MMSE、DSR評(píng)分均低于NC組和aMCI組，ADL、CDR評(píng)分均高于NC組和aMCI組(P<0.05)；aMCI組的DSR評(píng)分低于NC組(P<0.01)，CDR評(píng)分高于NC組(P<0.01)，aMCI組與NC組的MMSE、ADL評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.33組差異腸道菌群相對(duì)豐度比較 3組受試者的擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目相對(duì)豐度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組受試者的厚壁菌門、β變形菌綱、梭菌綱、伯克菌目、梭菌目、產(chǎn)堿桿菌科、梭菌科、薩特菌屬相對(duì)豐度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AD組的β變形菌綱、伯克菌目、產(chǎn)堿桿菌科、薩特菌屬相對(duì)豐度均高于NC組(P<0.05)，厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對(duì)豐度低于NC組(P<0.05)；aMCI組的產(chǎn)堿桿菌科、薩特菌屬相對(duì)豐度高于NC組(P<0.05)，厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目相對(duì)豐度低于NC組(P<0.05)，aMCI組與NC組的β變形菌綱、伯克菌目、梭菌科相對(duì)豐度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AD組與aMCI組的差異腸道菌群相對(duì)豐度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 3組受試者的認(rèn)知功能比較 [分，M(P25，P75)]

2.4差異腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性 將上述差異菌群的相對(duì)豐度與認(rèn)知功能測(cè)試分?jǐn)?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，不同分類水平上厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對(duì)豐度與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，β變形菌綱、伯克菌目、產(chǎn)堿桿菌科、薩特菌屬相對(duì)豐度與MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；不同分類水平上厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對(duì)豐度與DSR評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，β變形菌綱、伯克菌目、產(chǎn)堿桿菌科、薩特菌屬相對(duì)豐度與DSR評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討 論

人體內(nèi)定居著大量的微生物，據(jù)估計(jì)，人體內(nèi)存在500～1 000種細(xì)菌[19]，其中大部分定居在腸道[20]。腸道菌群通過(guò)免疫、循環(huán)和神經(jīng)途徑調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，反過(guò)來(lái)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)應(yīng)激和內(nèi)分泌反應(yīng)塑造腸道微生物群落，這種腸-腦軸的雙向作用可能與復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[21]。腸道菌群導(dǎo)致AD的機(jī)制可能始于腸道微生物群失調(diào)、局部和全身炎癥的發(fā)展以及腸-腦軸的失調(diào)，腸上皮屏障通透性的增加導(dǎo)致細(xì)菌、病毒及其神經(jīng)活性產(chǎn)物的侵襲，并引起大腦的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致AD[22]。但既往對(duì)于AD患者腸道菌群與認(rèn)知功能關(guān)系的研究仍不充分。

表3 3組受試者的差異腸道菌群相對(duì)豐度比較

表4 差異腸道菌群相對(duì)豐度與認(rèn)知功能的相關(guān)性

擬桿菌門和厚壁菌門是腸道菌群中的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。本研究結(jié)果顯示，AD患者擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目增加，aMCI和AD患者的厚壁菌門均減少，且厚壁菌門與MMSE和DSR評(píng)分呈正相關(guān)，提示人體腸道中擬桿菌門和厚壁菌門菌群的改變可能導(dǎo)致總體認(rèn)知功能和情景記憶功能的下降，進(jìn)而促進(jìn)AD的發(fā)生和進(jìn)展。目前，對(duì)于AD患者腸道菌群的研究仍存在爭(zhēng)議。Vogt等[23]研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的腸道菌群中厚壁菌門減少、擬桿菌門增加；也有研究顯示，AD患者的腸道菌群中擬桿菌門減少[24]。這些研究的樣本量較小，難以得出一致的結(jié)論，故需要大樣本的研究提供更為可靠的證據(jù)。

人體內(nèi)的腸道菌群通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸對(duì)結(jié)腸黏膜的結(jié)構(gòu)完整性和代謝功能發(fā)揮重要作用，其中乙酸、丙酸和丁酸是腸腔中含量最豐富的短鏈脂肪酸[7]。擬桿菌主要產(chǎn)生乙酸和丙酸鹽，而厚壁菌主要產(chǎn)生丁酸鹽。丁酸鹽是結(jié)腸細(xì)胞的主要能量來(lái)源，已證明其可增加小鼠的胰島素敏感性，并有抗炎作用，且有潛在的“抗肥胖”作用[25]。在糖尿病[26]和肥胖[27]人群中厚壁菌門減少，而糖尿病和肥胖是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[28-29]。此外，丁酸鹽還可能通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激、作為組蛋白去乙?；敢种苿┓乐股窠?jīng)元死亡[30]。

有研究顯示，在Aβ寡聚體誘導(dǎo)的AD小鼠腸道菌群中梭菌顯著減少[31]。本研究中AD患者腸道菌群中梭菌綱、梭菌目、梭菌科顯著減少，且相關(guān)性分析顯示梭菌相對(duì)豐度的減少與情景記憶功能和總體認(rèn)知水平下降有關(guān)。有學(xué)者對(duì)2型糖尿病患者腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)梭菌綱顯著降低[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性硬化患者的腸道菌群中梭狀芽孢桿菌ⅪVa和Ⅳ明顯減少甚至耗竭[32]，由于多發(fā)性硬化是一種影響大腦和脊髓的自身免疫性疾病，而梭狀芽孢桿菌所生產(chǎn)的丁酸能夠維持結(jié)腸上皮穩(wěn)態(tài)并通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用，故研究者推測(cè)大量產(chǎn)丁酸梭狀芽孢桿菌的缺失與多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。因此，作為丁酸的生產(chǎn)者，厚壁菌門及其下屬的梭狀芽孢桿菌可能通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激、增加胰島素敏感性等對(duì)AD相關(guān)的認(rèn)知功能產(chǎn)生積極影響。

擬桿菌門、變形菌門均屬于革蘭陰性菌，可分泌大量的脂多糖，脂多糖可能作用于白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體4，促進(jìn)核因子κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而升高Aβ水平，損害少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘，同時(shí)，Aβ1～42也是Toll樣受體4的激動(dòng)劑，可引起Aβ水平升高，形成惡性循環(huán)，加重AD進(jìn)展[33]。伯克菌目是β變形菌綱中的一個(gè)目，產(chǎn)堿桿菌科是伯克菌目中的一個(gè)科，薩特菌屬是產(chǎn)堿桿菌科的一個(gè)屬，與其他變形菌一樣，均屬于革蘭陰性菌。本研究結(jié)果顯示，AD組β變形菌綱、伯克菌目、產(chǎn)檢桿菌科、薩特菌屬的相對(duì)豐度顯著升高，且與MMSE評(píng)分以及DSR評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，這可能與其分泌的脂多糖導(dǎo)致認(rèn)知損害有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，口服益生菌(乳雙歧桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌)可顯著改善老年SAMP8小鼠的記憶缺陷、腦神經(jīng)元和突觸損傷、膠質(zhì)細(xì)胞活化，并改善腸道和大腦中的菌群組成，同時(shí)減輕腸屏障和血腦屏障的破壞，降低血漿和大腦中的脂多糖水平，在信使RNA水平上降低大腦和腸道的炎癥因子水平[34]。

綜上所述，擬桿菌門、厚壁菌門、梭菌綱、變形菌綱及其部分下屬的菌群改變可能導(dǎo)致AD患者認(rèn)知功能下降，可能促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。因此，腸道菌群可能成為AD的生物標(biāo)志物，且可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)預(yù)防和治療疾病。但本研究屬于橫斷面研究，難以得出腸道菌群變化與AD認(rèn)知功能變化的因果關(guān)系，且樣本量較小，可能存在偏倚，需要大樣本、前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。