毛俊峰 黃向華 衛(wèi)穎澤 程春 陳櫞 吳曉丹

(南通市腫瘤醫(yī)院 1.外科，2.病理科,江蘇 南通 226001)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤病例的25%?；熕幬镌谌橄侔┑闹委熤衅鹬e足輕重的作用，但化療后近一半的患者對藥物化療產(chǎn)生了多藥耐藥性，使得臨床化療效果遠不能令人滿意[1-3]。因此，探索耐藥發(fā)生的分子機制對于乳腺癌藥物化療具有至關重要的作用。研究證實，腫瘤細胞內蛋白分子的異常表達參與了腫瘤細胞的耐藥，有文獻報道，X盒結合蛋白1(XBP1)在乳腺癌[4]、結直腸癌[5]、膀胱癌[6]等多種腫瘤耐藥細胞中高表達，此外，研究進一步發(fā)現(xiàn)XBP1促進乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性[7]。miRNA是一類非編碼小RNA，研究證實，miRNA的異常表達通過調控下游基因在乳腺癌細胞對阿霉素耐藥過程中發(fā)揮作用，如，miR-452可以調節(jié)胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)緩解乳腺癌MCF-7細胞對阿霉素的耐藥性[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在乳腺癌細胞中作為一類抑癌基因低表達[9-11]，并通過調控下游基因參與乳腺癌的化療敏感性[12]。但miR-135b-5p通過調控XBP1對乳腺癌細胞阿霉素耐藥性敏感性的機制并不清楚。因此，本研究將通過檢測XBP1對MCF-7/DOXR細胞化療抵抗性細胞生物學行為的影響，并進一步探討miR-135b-5p通過靶向調控下游XBP1影響對阿霉素敏感性的機制介導MCF-7/DOXR細胞放療抵抗作用的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系和主要試劑 乳腺癌細胞系MCF-7(貨號：ATCC HTB-22)、MDA-MB-231(貨號：ATCC HTB-26)購買于ATCC細胞庫；正常乳腺細胞珠Hs 578Bst(貨號：BNCC337668)均購買于BNCC細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和TRIzol試劑盒購于Thermo Fisher Scientifi公司；10%FBS、青霉素和鏈霉素購于Biowest公司；阿霉素購自ApexBio公司；PrimeScript cDNA試劑盒和LipofectamineTM2000購于Takara公司；SYBR Green I Master qRT-PCR試劑盒購于Roche公司；免疫印跡一抗(Anti-XBP1)和二抗(羊抗兔IgG)從Cell Signaling Technology購買；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；miR-135b-5p mimics/inhibitor、sh-XBP1/pcDNA-XBP1載體以及引物由GenePharma公司構建和購買； Annexin V-FITC/PI購自KeyGENBioTECH公司；雙熒光素酶載體和試劑盒購于Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染、藥物處理及分組 MCF-7(親本MCF-7細胞)、MDA-MB-231細胞系和Hs 578Bst細胞采用含10%FBS、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；隨后將MCF-7細胞暴露于劑量遞增的阿霉素(0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 μm)中，當MCF-7細胞無凋亡并能穩(wěn)定增殖是表明MCF-7/DOXR構建成功。取對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細胞接種于6孔板中，調整細胞密度為1×104細胞/孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，之后按照LipofectamineTM2000說明書轉染陰性對照(NC組)、sh-XBP1(sh-XBP1組)、miR-135b-5p mimics/inhibitor(miR-135bp-5p mimices/inhibitor組)，待轉染72 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染效果。為了探究MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性，細胞成功轉染NC、sh-XBP1(敲降XBP1)、miR-135b-5p mimics后經(jīng)過阿霉素處理，即NC+DOXR組、sh-XBP1+DOXR組、miR-135b-5p mimics+DOXR組。為了探究MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性的機制，細胞成功轉染NC、miR-135b-5p mimics、pcDNA XBP1(過表達XBP1)+miR-135b-5p mimics后經(jīng)過阿霉素處理，即NC+DOXR組、miR-135b-5p mimics+DOXR組、pcDNA XBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組。

1.3 RT-qPCR檢測miR-135b-5p和XBP1 mRNA的表達 使用TRIzol試劑分離總RNA。使用PrimeScript cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，采用SYBR Green I Master qRT-PCR試劑盒將逆轉錄產(chǎn)物進行PCR，分別以β-actin和U6為內參檢測miR-135b-5p和XBP1 mRNA的表達，引物序列如下：miR-135b-5p F: 5′-CGGGCTATGGCTTTTTATTCC-3′、miR-135b-5p R: 5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；U6 F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′,U6-R: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；XBP1 F: 5′-TCCTGTTGGGCATTCTGGAC-3′,XBP1 R: 5′-GG CTGGTAAGGAACTGGGTC-3′；β-actin F: 5′-CCG TTCCGAAAGTTGCCTTTT-3′,β-actin R: 5′-ATC ATCCATGGTGAGCTGGC-3′；PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，進行40個循環(huán)。檢測結果采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.4 Western bolt檢測細胞XBP1蛋白表達水平 收集經(jīng)處理的MCF-7/DOXR細胞，采用RIPA裂解30 min，4 ℃下以14，000×g離心15 min去除細胞沉淀。用Nanodrop 2000分光光度法對蛋白質進行定量，10%SDS-PAGE分離蛋白，并將其轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在5%脫脂奶粉中封閉2 h后4°C下用一抗(1∶1500)孵育過夜，次日緩沖液沖洗膜3次后加入二抗(1∶5000)室溫孵育1h。用TBST洗滌后，加入ECL化學發(fā)光液顯色，采用Image J軟件分析靶帶的灰度水平。

1.5 CCK-8實驗檢測MCF-7/DOXR細胞增殖活力 收集經(jīng)處理并處于對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細胞接種于96孔板，調整細胞密度為1×104細胞/孔，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)培養(yǎng)，在檢測前，向每孔加10 μL CCK-8溶液后避光孵育4 h，采用酶標儀檢測450nm處的OD值。

1.6 Annexin-V-FITC雙染流式術檢測MCF-7/DOXR細胞凋亡水平 收集經(jīng)處理并處于對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細胞，PBS清洗2次后與500 μL預冷的1×結合緩沖液混合，室溫下將溶液與5 μL Annexin-V-FITC和10 μL Propidium Iodide均勻混合避光雙染15 min后檢測MCF-7/DOXR細胞的凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-135b-5p與XBP1靶向關系 合成XBP1 mRNA的3，-UTR并將其克隆到pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體上構建pmirGLO-XBP1-WT/MUT載體，將NC/miR-135b-5p mimics與pmirGLO-XBP1-WT/MUT構建重組質粒，將構建的質粒與對照組與LipofectamineTM2000混合后轉染293T細胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1 XBP1在乳腺癌細胞系和阿霉素耐藥細胞珠MCF-7/DOXR中高表達 RT-qPCR檢測結果表明，在乳腺癌細胞系中XBP1 mRNA的表達顯著高于Hs 578Bst細胞(P<0.05)，MCF-7/DOXR細胞中XBP1 mRNA的表達顯著高于親本MCF-7細胞(P<0.05)(見圖1A)。Westernblot結果表明，與Hs 578Bst細胞相比，XBP1在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著升高(P<0.05)，MCF-7/DOXR細胞中XBP1的表達顯著高于親本MCF-7細胞(P<0.05)(見圖1B)。CCK-8檢測結果表明，不同濃度的阿霉素對MCF-7/DOXR細胞增殖活力有顯著的抑制作用，IC50值為1.91 μmol/L(P<0.05)(見圖1C)，后續(xù)實驗采用2.0 μmol/L的阿霉素處理MCF-7/DOXR細胞。實驗結果表明，XBP1在乳腺癌細胞系和阿霉素耐藥細胞珠株MCF-7/DOXR中高表達。

圖1 XBP1在乳腺癌細胞系和順鉑耐藥細胞珠MCF-7/DOXR中高表達

2.2 敲降XBP1促進MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性 Westernblot結果表明，敲降XBP1顯著下調了MCF-7/DOXR細胞中XBP1的表達水平(P<0.05)(見圖2A)。CCK-8檢測細胞增殖結果表明，與NC+DOXR組相比，sh-XBP1+ DOXR組顯著抑制MCF-7/DOXR細胞增殖活力(P<0.05)(見圖2B)。Annexin V-FITC /PI檢測細胞凋亡結果表明，與NC+DOXR組相比，sh-XBP1+ DOXR組顯著促進MCF-7/DOXR細胞凋亡水平(P<0.05)(見圖2C)。結果表明敲降XBP1促進MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性。

圖2 敲降XBP1促進MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性

2.3 miR-135b-5p與XBP1的靶向關系 通過Starbase(http://www.starbase.sysu.edu.cn)數(shù)據(jù)庫預測結果發(fā)現(xiàn)，XBP1是miR-135b-5p下游潛在靶標(見圖3A)。同時，雙熒光素酶報告基因驗證發(fā)現(xiàn)，過表達miR-135b-5p可顯著下調XBP1野生型質粒內熒光強度(P<0.05)(見圖3B)。Western blot檢測結果表明，在MCF-7/DOXR細胞中敲降miR-135b-5p顯著上調XBP1的表達(P<0.05)(見圖3C)。結果表明，miR-135b-5p下調XBP1的表達。

圖3 miR-135b-5p下調XBP1的表達

2.4 過表達miR-135b-5p 通過下調XBP1促進促進MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性，RT-qPCR檢測結果表明，在MCF-7/DOXR細胞中轉染miR-135b-5p mimics可顯著上調miR-135b-5p的表達水平(P<0.05)(見圖4A)；Westernblot檢測結果表明，在MCF-7/DOXR細胞中轉染miR-135b-5p mimics可顯著下調XBP1的表達水平；而同時過表達XBP1和miR-135b-5p的MCF-7/DOXR細胞中XBP1的表達水平與對NC組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CCK-8檢測MCF-7/DOXR細胞增殖結果表明，與NC+DOXR組相比，miR-135b-5p mimic+DOXR組處理后顯著抑制MCF-7/DOXR細胞增殖活力(P<0.05)(見圖4B)，pcDNAXBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組MCF-7/DOXR細胞增殖活力與NC+DOXR組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Annexin V-FITC/PI檢測MCF-7/DOXR細胞凋亡結果表明，與NC組與DOXR組相比，miR-135b-5p mimic+DOXR組顯著促進MCF-7/DOXR細胞凋亡水平(P<0.05)(見圖4C)，而pcDNA XBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組的MCF-7/DOXR細胞凋亡水平與NC組與DOXR組相比差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4D)。結果表明，過表達miR-135b-5p通過下調XBP1促進MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性。

圖4 miR-135b-5p靶向XBP1調控MCF-7/DOXR細胞對阿霉素的敏感性

3 討論

XBP1是一種堿性亮氨酸拉鏈結構蛋白，參與了未折疊的蛋白應答(UPR)和內質網(wǎng)(ER)應激激活，UPR是由ER應激激活的一組信號傳導途徑，已被證明是治療腫瘤耐藥的關鍵機制之一[7,13-14]，研究證實XBP1能效誘導UPR發(fā)生進而在乳腺癌[13-14]，膀胱癌[6]等多種腫瘤細胞耐藥機制中發(fā)揮重要調控，Clarke等[15]發(fā)現(xiàn)XBP1過表達導致乳腺癌細胞對他莫昔芬和faslodex的敏感性降低；Chen等[4]證實當下調XBP1時通過抑制HIF途徑抑制了腫瘤的生長和藥物化療后的復發(fā)，Ding等[16]及團隊也證實XBP1表達在抗雌激素治療的乳腺癌細胞系中增加，并且在乳腺癌腫瘤中與雌激素受體α(ERα)共表達促進乳腺癌細胞的耐藥，在本研究中，發(fā)現(xiàn)XBP1的表達水平與乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性有關，當上調XBP1時能促進MCF-7/DOXR細胞凋亡并抑制起增殖，增加了對阿霉素敏感性，此外，有文獻[17]報道，細胞角蛋白19通過上調XBP1表達增強乳腺癌BT549細胞的耐藥；miR-34a通過下調XBP1促進性髓細胞白血病(AML)細胞系對硼替佐米等藥物化療的敏感性[18]，這表明其他分子機制能通過調節(jié)XBP1的表達進而在腫瘤耐藥機制中發(fā)揮作用。本研究進一步發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p可以靶向下調XBP1的表達。

miRNA在多種細胞過程(例如增殖和分化)中發(fā)揮重要作用，同時，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為腫瘤耐藥性的預測指標在包括乳腺癌的多種惡性腫瘤耐藥中異常表達[19-20]。如Hu等[8]證實miR-452可以調節(jié)胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)緩解乳腺癌MCF-7細胞對阿霉素的耐藥性，Zeng等[21]發(fā)現(xiàn)miR-129-5p通過靶向下調SOX2抑制乳腺癌中的阿霉素耐藥性。然而，miRNA介導的XBP1在乳腺癌中耐藥中的調控尚不清楚。本研究根據(jù)生物信息學預測并結合雙熒光素報告基因實驗發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p可以靶向負調控XBP1的表達。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在乳腺癌細胞中作為一類抑癌基因低表達[9]；Zhang等[12]研究也發(fā)現(xiàn)上調miR-135b-5p能促進乳腺癌細胞的對阿霉素的化療敏感性；此結果和本研究結果一致，同時本研究證實miR-135b-5p在細胞中低表達并靶向下調XBP1蛋白表達水平，當上調miR-135b-5p能增強MCF-7/DOXR細胞對阿霉素敏感性。

4 結論

本研究結果提示，miR-135b-5p通過下調XBP1促進細胞凋亡并抑制其增殖，此次實驗結果在一定程度上將為今后臨床上乳腺癌阿霉素耐藥的治療提供新的研究思路。