毛俊峰 黃向華 衛(wèi)穎澤 程春 陳櫞 吳曉丹

(南通市腫瘤醫(yī)院 1.外科，2.病理科,江蘇 南通 226001)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤病例的25%。化療藥物在乳腺癌的治療中起著舉足輕重的作用，但化療后近一半的患者對藥物化療產(chǎn)生了多藥耐藥性，使得臨床化療效果遠(yuǎn)不能令人滿意[1-3]。因此，探索耐藥發(fā)生的分子機(jī)制對于乳腺癌藥物化療具有至關(guān)重要的作用。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的異常表達(dá)參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥，有文獻(xiàn)報(bào)道，X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)在乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌[5]、膀胱癌[6]等多種腫瘤耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，此外，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)XBP1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥性[7]。miRNA是一類非編碼小RNA，研究證實(shí)，miRNA的異常表達(dá)通過調(diào)控下游基因在乳腺癌細(xì)胞對阿霉素耐藥過程中發(fā)揮作用，如，miR-452可以調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)緩解乳腺癌MCF-7細(xì)胞對阿霉素的耐藥性[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在乳腺癌細(xì)胞中作為一類抑癌基因低表達(dá)[9-11]，并通過調(diào)控下游基因參與乳腺癌的化療敏感性[12]。但miR-135b-5p通過調(diào)控XBP1對乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性敏感性的機(jī)制并不清楚。因此，本研究將通過檢測XBP1對MCF-7/DOXR細(xì)胞化療抵抗性細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步探討miR-135b-5p通過靶向調(diào)控下游XBP1影響對阿霉素敏感性的機(jī)制介導(dǎo)MCF-7/DOXR細(xì)胞放療抵抗作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(貨號：ATCC HTB-22)、MDA-MB-231(貨號：ATCC HTB-26)購買于ATCC細(xì)胞庫；正常乳腺細(xì)胞珠Hs 578Bst(貨號：BNCC337668)均購買于BNCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和TRIzol試劑盒購于Thermo Fisher Scientifi公司；10%FBS、青霉素和鏈霉素購于Biowest公司；阿霉素購自ApexBio公司；PrimeScript cDNA試劑盒和LipofectamineTM2000購于Takara公司；SYBR Green I Master qRT-PCR試劑盒購于Roche公司；免疫印跡一抗(Anti-XBP1)和二抗(羊抗兔IgG)從Cell Signaling Technology購買；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；miR-135b-5p mimics/inhibitor、sh-XBP1/pcDNA-XBP1載體以及引物由GenePharma公司構(gòu)建和購買； Annexin V-FITC/PI購自KeyGENBioTECH公司；雙熒光素酶載體和試劑盒購于Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、藥物處理及分組 MCF-7(親本MCF-7細(xì)胞)、MDA-MB-231細(xì)胞系和Hs 578Bst細(xì)胞采用含10%FBS、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；隨后將MCF-7細(xì)胞暴露于劑量遞增的阿霉素(0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 μm)中，當(dāng)MCF-7細(xì)胞無凋亡并能穩(wěn)定增殖是表明MCF-7/DOXR構(gòu)建成功。取對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104細(xì)胞/孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，之后按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染陰性對照(NC組)、sh-XBP1(sh-XBP1組)、miR-135b-5p mimics/inhibitor(miR-135bp-5p mimices/inhibitor組)，待轉(zhuǎn)染72 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。為了探究MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性，細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染NC、sh-XBP1(敲降XBP1)、miR-135b-5p mimics后經(jīng)過阿霉素處理，即NC+DOXR組、sh-XBP1+DOXR組、miR-135b-5p mimics+DOXR組。為了探究MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性的機(jī)制，細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染NC、miR-135b-5p mimics、pcDNA XBP1(過表達(dá)XBP1)+miR-135b-5p mimics后經(jīng)過阿霉素處理，即NC+DOXR組、miR-135b-5p mimics+DOXR組、pcDNA XBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組。

1.3 RT-qPCR檢測miR-135b-5p和XBP1 mRNA的表達(dá) 使用TRIzol試劑分離總RNA。使用PrimeScript cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green I Master qRT-PCR試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，分別以β-actin和U6為內(nèi)參檢測miR-135b-5p和XBP1 mRNA的表達(dá)，引物序列如下：miR-135b-5p F: 5′-CGGGCTATGGCTTTTTATTCC-3′、miR-135b-5p R: 5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；U6 F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′,U6-R: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；XBP1 F: 5′-TCCTGTTGGGCATTCTGGAC-3′,XBP1 R: 5′-GG CTGGTAAGGAACTGGGTC-3′；β-actin F: 5′-CCG TTCCGAAAGTTGCCTTTT-3′,β-actin R: 5′-ATC ATCCATGGTGAGCTGGC-3′；PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 Western bolt檢測細(xì)胞XBP1蛋白表達(dá)水平 收集經(jīng)處理的MCF-7/DOXR細(xì)胞，采用RIPA裂解30 min，4 ℃下以14，000×g離心15 min去除細(xì)胞沉淀。用Nanodrop 2000分光光度法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，10%SDS-PAGE分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在5%脫脂奶粉中封閉2 h后4°C下用一抗(1∶1500)孵育過夜，次日緩沖液沖洗膜3次后加入二抗(1∶5000)室溫孵育1h。用TBST洗滌后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，采用Image J軟件分析靶帶的灰度水平。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖活力 收集經(jīng)處理并處于對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104細(xì)胞/孔，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)培養(yǎng)，在檢測前，向每孔加10 μL CCK-8溶液后避光孵育4 h，采用酶標(biāo)儀檢測450nm處的OD值。

1.6 Annexin-V-FITC雙染流式術(shù)檢測MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡水平 收集經(jīng)處理并處于對數(shù)生長期的MCF-7/DOXR細(xì)胞，PBS清洗2次后與500 μL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液混合，室溫下將溶液與5 μL Annexin-V-FITC和10 μL Propidium Iodide均勻混合避光雙染15 min后檢測MCF-7/DOXR細(xì)胞的凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135b-5p與XBP1靶向關(guān)系 合成XBP1 mRNA的3，-UTR并將其克隆到pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體上構(gòu)建pmirGLO-XBP1-WT/MUT載體，將NC/miR-135b-5p mimics與pmirGLO-XBP1-WT/MUT構(gòu)建重組質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒與對照組與LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 XBP1在乳腺癌細(xì)胞系和阿霉素耐藥細(xì)胞珠MCF-7/DOXR中高表達(dá) RT-qPCR檢測結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞系中XBP1 mRNA的表達(dá)顯著高于Hs 578Bst細(xì)胞(P<0.05)，MCF-7/DOXR細(xì)胞中XBP1 mRNA的表達(dá)顯著高于親本MCF-7細(xì)胞(P<0.05)(見圖1A)。Westernblot結(jié)果表明，與Hs 578Bst細(xì)胞相比，XBP1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，MCF-7/DOXR細(xì)胞中XBP1的表達(dá)顯著高于親本MCF-7細(xì)胞(P<0.05)(見圖1B)。CCK-8檢測結(jié)果表明，不同濃度的阿霉素對MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖活力有顯著的抑制作用，IC50值為1.91 μmol/L(P<0.05)(見圖1C)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用2.0 μmol/L的阿霉素處理MCF-7/DOXR細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XBP1在乳腺癌細(xì)胞系和阿霉素耐藥細(xì)胞珠株MCF-7/DOXR中高表達(dá)。

圖1 XBP1在乳腺癌細(xì)胞系和順鉑耐藥細(xì)胞珠MCF-7/DOXR中高表達(dá)

2.2 敲降XBP1促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性 Westernblot結(jié)果表明，敲降XBP1顯著下調(diào)了MCF-7/DOXR細(xì)胞中XBP1的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖2A)。CCK-8檢測細(xì)胞增殖結(jié)果表明，與NC+DOXR組相比，sh-XBP1+ DOXR組顯著抑制MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖活力(P<0.05)(見圖2B)。Annexin V-FITC /PI檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，與NC+DOXR組相比，sh-XBP1+ DOXR組顯著促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡水平(P<0.05)(見圖2C)。結(jié)果表明敲降XBP1促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性。

圖2 敲降XBP1促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性

2.3 miR-135b-5p與XBP1的靶向關(guān)系 通過Starbase(http://www.starbase.sysu.edu.cn)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XBP1是miR-135b-5p下游潛在靶標(biāo)(見圖3A)。同時(shí)，雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-135b-5p可顯著下調(diào)XBP1野生型質(zhì)粒內(nèi)熒光強(qiáng)度(P<0.05)(見圖3B)。Western blot檢測結(jié)果表明，在MCF-7/DOXR細(xì)胞中敲降miR-135b-5p顯著上調(diào)XBP1的表達(dá)(P<0.05)(見圖3C)。結(jié)果表明，miR-135b-5p下調(diào)XBP1的表達(dá)。

圖3 miR-135b-5p下調(diào)XBP1的表達(dá)

2.4 過表達(dá)miR-135b-5p 通過下調(diào)XBP1促進(jìn)促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性，RT-qPCR檢測結(jié)果表明，在MCF-7/DOXR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b-5p mimics可顯著上調(diào)miR-135b-5p的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖4A)；Westernblot檢測結(jié)果表明，在MCF-7/DOXR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b-5p mimics可顯著下調(diào)XBP1的表達(dá)水平；而同時(shí)過表達(dá)XBP1和miR-135b-5p的MCF-7/DOXR細(xì)胞中XBP1的表達(dá)水平與對NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8檢測MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖結(jié)果表明，與NC+DOXR組相比，miR-135b-5p mimic+DOXR組處理后顯著抑制MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖活力(P<0.05)(見圖4B)，pcDNAXBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組MCF-7/DOXR細(xì)胞增殖活力與NC+DOXR組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Annexin V-FITC/PI檢測MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，與NC組與DOXR組相比，miR-135b-5p mimic+DOXR組顯著促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡水平(P<0.05)(見圖4C)，而pcDNA XBP1+miR-135b-5p mimics+DOXR組的MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡水平與NC組與DOXR組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4D)。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-135b-5p通過下調(diào)XBP1促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性。

圖4 miR-135b-5p靶向XBP1調(diào)控MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素的敏感性

3 討論

XBP1是一種堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白，參與了未折疊的蛋白應(yīng)答(UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激激活，UPR是由ER應(yīng)激激活的一組信號傳導(dǎo)途徑，已被證明是治療腫瘤耐藥的關(guān)鍵機(jī)制之一[7,13-14]，研究證實(shí)XBP1能效誘導(dǎo)UPR發(fā)生進(jìn)而在乳腺癌[13-14]，膀胱癌[6]等多種腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控，Clarke等[15]發(fā)現(xiàn)XBP1過表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬和faslodex的敏感性降低；Chen等[4]證實(shí)當(dāng)下調(diào)XBP1時(shí)通過抑制HIF途徑抑制了腫瘤的生長和藥物化療后的復(fù)發(fā)，Ding等[16]及團(tuán)隊(duì)也證實(shí)XBP1表達(dá)在抗雌激素治療的乳腺癌細(xì)胞系中增加，并且在乳腺癌腫瘤中與雌激素受體α(ERα)共表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥，在本研究中，發(fā)現(xiàn)XBP1的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性有關(guān)，當(dāng)上調(diào)XBP1時(shí)能促進(jìn)MCF-7/DOXR細(xì)胞凋亡并抑制起增殖，增加了對阿霉素敏感性，此外，有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，細(xì)胞角蛋白19通過上調(diào)XBP1表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌BT549細(xì)胞的耐藥；miR-34a通過下調(diào)XBP1促進(jìn)性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞系對硼替佐米等藥物化療的敏感性[18]，這表明其他分子機(jī)制能通過調(diào)節(jié)XBP1的表達(dá)進(jìn)而在腫瘤耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p可以靶向下調(diào)XBP1的表達(dá)。

miRNA在多種細(xì)胞過程(例如增殖和分化)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為腫瘤耐藥性的預(yù)測指標(biāo)在包括乳腺癌的多種惡性腫瘤耐藥中異常表達(dá)[19-20]。如Hu等[8]證實(shí)miR-452可以調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)緩解乳腺癌MCF-7細(xì)胞對阿霉素的耐藥性，Zeng等[21]發(fā)現(xiàn)miR-129-5p通過靶向下調(diào)SOX2抑制乳腺癌中的阿霉素耐藥性。然而，miRNA介導(dǎo)的XBP1在乳腺癌中耐藥中的調(diào)控尚不清楚。本研究根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測并結(jié)合雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p可以靶向負(fù)調(diào)控XBP1的表達(dá)。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)miR-135b-5p在乳腺癌細(xì)胞中作為一類抑癌基因低表達(dá)[9]；Zhang等[12]研究也發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-135b-5p能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的對阿霉素的化療敏感性；此結(jié)果和本研究結(jié)果一致，同時(shí)本研究證實(shí)miR-135b-5p在細(xì)胞中低表達(dá)并靶向下調(diào)XBP1蛋白表達(dá)水平，當(dāng)上調(diào)miR-135b-5p能增強(qiáng)MCF-7/DOXR細(xì)胞對阿霉素敏感性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，miR-135b-5p通過下調(diào)XBP1促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上將為今后臨床上乳腺癌阿霉素耐藥的治療提供新的研究思路。