王潔 劉單 鄧述愷

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000)

全球肺癌的發(fā)生率和死亡率均居所有癌癥首位，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌類型的85%左右[1]。盡管目前肺癌治療方式較多，但化療仍是肺癌治療的重要基石之一。培美曲塞是一種多靶點的抗葉酸化療藥物，主要是基于其抑制高增殖細胞中葉酸代謝的能力，被推薦用于非鱗非小細胞肺癌的一線治療[2]，目前CSCO指南推薦培美曲塞是一種有效的聯(lián)合免疫檢查點阻斷治療晚期非小細胞肺癌的藥物。但其對腫瘤免疫的影響，特別是對NSCLC免疫的影響，尚未得到充分的研究。程 序 性 死 亡 受 體-1(PD-1)屬于抑制性T細胞受體，通常由活化的T細胞和長期暴露于各種抗原的抗原特異性T細胞表達，其配體程序性細胞死亡配體-1(PD-L1)在包括NSCLC在內(nèi)的多種人類癌癥中經(jīng)常高表達，與預(yù)后不良有關(guān)[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase，AKT)信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、存活和遷移的多種生物活性中起著關(guān)鍵作用，該信號通路的激活是許多人類癌癥生長的核心[4-5]。本實驗擬通過Pem對HCC827細胞株P(guān)D-L1表達的影響，初步探討其可能的作用機制，為Pem抗腫瘤效應(yīng)可能與抑制PD-L1的表達從而消除腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用相關(guān)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 HCC827細胞株，DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)；Pem(美國Selleck生物科技有限公司)；CCK-8檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)；PD-L1單克隆抗體(eBioscience)、AKT 、p-AKT 一抗(美國 CST 公司)；內(nèi)參GAPDH抗體(英國 Abcam 公司)；流式細胞儀(美國 BD 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及傳代 將HCC827細胞系在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后放置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長，貼壁生長到一定程度后，經(jīng)胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 采用CCK-8 法測定不同濃度及時間時Pem對細胞增殖的抑制作用 收集對數(shù)生長期的HCC827細胞，接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，分為對照組(加入培養(yǎng)液)和實驗組(Pem濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L )，每組設(shè) 5 個重復(fù)，分別孵育12、24和48 h，每孔分別加入CCK-8 試劑10uL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。使用酶標儀測定450nm光密度值(OD)，同時計算細胞增殖抑制率及半抑制濃度(IC50)用于后續(xù)實驗，細胞存活率%=(1- OD實驗組/ OD對照組)×100%。實驗結(jié)果表明，48h對細胞抑制效果最好，并以此作為后續(xù)實驗時間。

1.2.3 流式細胞儀測定不同濃度Pem對細胞PD-L1表達影響 按照1×105個/mL將HCC827 細胞株接種于 6 孔板，實驗分組部分同 1.2.2，分別使用不同濃度Pem作用細胞48 h后，在超凈臺內(nèi)收集細胞，離心棄去上清液，分別加入 5μLPD-L1-PE 抗體標記，避光4℃孵育 20min，加1m L鞘液，震蕩混勻后，1500rpm 離心5min，棄去上清液，加入 200μL 鞘液，震蕩混勻后，流式細胞儀檢測，試驗重復(fù)3次。

1.2.4 WB檢測各實驗組AKT、P-AKT蛋白水平 將HCC827細胞接種于 96 孔培養(yǎng)板，實驗分為對照組(加入培養(yǎng)液)和實驗組，實驗組再分為Pem 組(加入 IC50 濃度的 Pem)、740-YP組(濃度為25nM)、740-YP(濃度為25nM)+Pem組(加入IC50 濃度的Pem)，每組設(shè) 5 個復(fù)孔。培育 48 h，細胞經(jīng)裂解液裂解后提取總蛋白。BCA蛋白濃度檢測，繪制標準曲線，計算各組待測蛋白的濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶密封1h， p-AKT 及AKT一抗 4℃過夜，緩沖液洗膜3次，后加二抗，室溫孵育30min，洗膜，ECL發(fā)光劑顯影、定影。采用GAPDH作為內(nèi)參用作標準對照，以上操作重復(fù)3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測各實驗組PD-L1表達 按照1×105個/mL將HCC827 細胞株接種于 6 孔板，分組部分同1.2.4，分別使用不同濃度Pem作用細胞48 h后，在超凈臺內(nèi)收集細胞，離心棄去上清液，分別加入 5μL PD-L1-PE 抗體標記，避光4℃孵育 20min，加1mL 鞘液，震蕩混勻后，1500rpm 離心5min，棄去上清液，加入 200μL 鞘液，震蕩混勻后，流式細胞儀檢測，以上試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的Pem對HCC827細胞增殖的抑制作用及IC50 CCK-8結(jié)果示，濃度為0.01、0.1、1、10、100μM Pem均可抑制HCC827細胞的增殖，且隨著藥物濃度的增加，增殖抑制效果更明顯，培美曲塞48h組抑制作用強于12h組(P<0.05)，與24h組抑制率無明顯差別(P>0.05)，見表1(Pem12h、24h及48h對應(yīng)的IC50值分別為0.441、0.309、0.171μmol/L)。

表1 不同濃度Pem對不同時間的HCC827生長抑制率比較

2.2 不同濃度Pem對HCC827細胞表面PD-L1表達的影響 作用于HCC827細胞48h條件下，對照組、0.01、0.1、1、10、100 μM Pem組其PD-L1表達量隨著藥物濃度增加逐漸下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=311.516，P<0.05)，見圖1、圖2。

圖2 各組HCC827細胞表面PD-L1的表達

2.3 Pem及740-YP對HCC827細胞AKT、P-AKT蛋白表達的影響 作用于HCC827細胞48h后，對照組、Pem組、740-YP組、Pem組+740-YP組P-AKT/GAPDH 值分別為(0.24±0.01)、(0.05±0.01)、(0.54±0.03)、(0.13±0.01)，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=486.716，均P<0.05)；與對照組比較，P-AKT/GAPDH 值在740-YP組上升(P<0.05)，在Pem組、Pem+740-YP組均下調(diào)(P<0.05)，且Pem組P-AKT/GAPDH 值低于Pem+740Y-P組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組、Pem組、740-YP組、Pem組+740-YP組AKT/GAPDH 值分別為(0.63±0.03)、(0.64±0.04)、(0.63±0.03)、(0.65±0.02)，4組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.294，P=0.828),見圖3、圖4、圖5。

圖3 HCC827細胞株P(guān)-AKT及AKT蛋白的表達

圖4 HCC827細胞株P(guān)-AKT蛋白的表達

圖5 HCC827細胞株AKT蛋白的表達

2.4 Pem及740Y-P對HCC827細胞PD-L1 表達的影響 作用于HCC827細胞48h后，對照組、Pem組、740-YP組、Pem+740Y-P組PD-L1表達量分別為(59.83±2.58)%、(32.5±1.04)%、(71.63±2.82)%、(41.1±2.48)%，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=172.951，均P<0.05)；與對照組比較，740-YP組PD-L1表達量上調(diào)(P<0.05)，Pem組、Pem+740-YP組PD-L1表達量均下降(P<0.05)，且Pem組PD-L1表達量低于Pem+740-YP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖6、圖7。

圖6 藥物對HCC827細胞表面PD-L1表達影響的比較

圖7 各組HCC827細胞表面PD-L1的表達

3 討論

目前認為，化療可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的免疫原性死亡(ICD)、提高腫瘤抗原性、阻斷免疫抑制途徑、增強效應(yīng)T細胞反應(yīng)等途徑來調(diào)節(jié)腫瘤免疫功能，從而改變免疫抑制腫瘤的微環(huán)境，增強免疫細胞的細胞毒性[6]。Pem是非小細胞肺癌的一線標準治療藥物，先前的研究表明，單獨使用培美曲塞或與其他化療藥物聯(lián)合使用可延長非小細胞肺癌患者的總體生存期[7]。目前KEYNOTE-Ⅲ期臨床實驗結(jié)果分析，帕博利珠單抗聯(lián)合Pem及鉑類治療已成為轉(zhuǎn)移性NSCLC的標準治療選擇之一，免疫療法聯(lián)合化療后，患者的總生存率、無進展生存期及客觀緩解率均得到了顯著的提高。

最近的研究表明，腫瘤細胞以幾種方式“編輯宿主”免疫，以逃避腫瘤微環(huán)境中的免疫防御，這種現(xiàn)象被稱為“癌癥免疫逃逸”。該系統(tǒng)中最重要的組成部分之一是由PD-1及其受體PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制共信號[8]。研究證明， PD-L1在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，可以減弱宿主對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)，其高表達與免疫逃逸相關(guān)[9]。PD-L1高表達最終可促進T細胞凋亡、無能和功能衰竭，從而使癌細胞逃脫T細胞的免疫監(jiān)視[10-11]。在胃癌中，PD-L1高表達患者的預(yù)后明顯比PD-L1低表達或缺乏表達的患者差[12]。Que Y 等[13]研究結(jié)果表明，過度表達PD-L1的軟組織肉瘤細胞， 與腫瘤分期晚、侵襲性強、預(yù)后不良相關(guān)，在肝細胞癌[14]、肺癌[15]等惡性癌癥中均有相似報道。同時有研究證實，腫瘤細胞高表達的PD-L1與T細胞表達的PD-1結(jié)合，導(dǎo)致PD-1/PD-L1通路處于持續(xù)激活狀態(tài)進而抑制T細胞的功能[16]，阻斷PD-1和PD-L1之間的相互作用可增強T細胞反應(yīng)并介導(dǎo)抗腫瘤活性[17-18]，以上結(jié)果表明，降低PD-L1的表達水平，可改善腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)Pem可下調(diào)PD-L1表達的水平，提示Pem抗腫瘤作用可能與下調(diào)PD-L1表達進而解除機體免疫抑制相關(guān)，通過Pem降低PD-L1的表達，進一步減少與PD-1的結(jié)合，這可能是Pem聯(lián)合PD-1抑制劑治療NSCLC的作用機制之一。

PI3K/AKT信號通路是人體主要的信號通路之一，該通路作為原癌基因發(fā)揮作用，有調(diào)節(jié)癌細胞存活及致癌轉(zhuǎn)化的可能機制，包括刺激增殖、生存、侵襲/轉(zhuǎn)移等不同生物功能，在包括肺癌在內(nèi)的各種癌癥中經(jīng)常被激活[19]，該信號通路不僅可通過刺激細胞增殖及降低細胞凋亡促進腫瘤的發(fā)展，同時可上調(diào)PD-L1的表達從而介導(dǎo)免疫逃逸[20]。Bo Li等[21]研究表明，Pem可以通過抑制PI3K/AKT信號通路和在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)促凋亡因子而抑制肺癌細胞的增殖。Gao Y[22]、Zhang X等[23]研究發(fā)現(xiàn)抑制 PI3K 激酶以及下游的信號分子AKT 可以下調(diào) PD- L1 的表達以及增強細胞毒 T 細胞殺傷腫瘤細胞的功能。以上研究提示，PD-L1可能是PI3K/AKT信號通路的作用靶點之一，Pem可能通過PI3K/AKT來調(diào)節(jié)PD-L1的表達。本研究結(jié)果顯示，Pem可使HCC827細胞PD-L1表達下降，使用740-YP激活該信號通路傳導(dǎo)途徑，可逆轉(zhuǎn)Pem引起的PD-L1表達下降。實驗結(jié)果表明，Pem可通過PI3K/AKT信號通路來調(diào)節(jié)PD-L1在腫瘤細胞的表達，與上述研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

Pem抑制人肺腺癌HCC827細胞的增殖，其機制可能與抑制PI3K/AKT通路激活，使PD-L1表達下調(diào)，減少與PD-1受體相互作用，降低因兩者結(jié)合引起的T細胞程序性死亡，從而恢復(fù)腫瘤細胞對機體的免疫應(yīng)答相關(guān)，同時Pem通過促進PD-L1表達減低，在腫瘤微環(huán)境中可為PD-1免疫檢查點抑制劑的療效創(chuàng)造有利條件，進一步提高治療效果。本實驗不足之處只在細胞水平上進行了研究，未來會進一步收集臨床血液樣本，為化療藥物對免疫的影響進行更深入的研究。