王曉娟 王惠玉

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，產(chǎn)芽孢，多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、動(dòng)物及其腸道中，是腸道的正常菌群之一，同時(shí)也是一種條件致病菌，能夠引起人類食物中毒和動(dòng)物壞死性腸炎的食源性疾病。《飲用天然礦泉水》（GB 8537-2018）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的要求是，從一批樣品中采集5件樣品，每件樣品的采樣量是50mL，均不得檢出?！讹嬘锰烊坏V泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538-2016）規(guī)定，飲用天然礦泉水需檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌，將其在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（簡(jiǎn)稱SPS）培養(yǎng)基上經(jīng)24h、36℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)，計(jì)數(shù)濾膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。但在這一環(huán)節(jié)會(huì)遇到一些不確定性因素，如目標(biāo)菌在特定的時(shí)間內(nèi)未生長(zhǎng)、菌落顏色為灰色等，從而影響檢測(cè)結(jié)果，不能真實(shí)反映樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在情況。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，增加活化的步驟，關(guān)注試驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以解決試驗(yàn)中遇到的類似問(wèn)題。

一、存在的問(wèn)題

1.在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，完全按照GB 8538-2016的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，濾膜上截留的產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS培養(yǎng)基上經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，并無(wú)明顯的黑色菌落，這就容易誤認(rèn)為被檢樣品中不含產(chǎn)氣莢膜梭菌，而導(dǎo)致漏檢。

2.對(duì)確定含有產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)濾膜無(wú)黑色菌落產(chǎn)生，只有少量灰色的菌落，再對(duì)其進(jìn)行確證試驗(yàn)，但生化現(xiàn)象不明顯，最終給出錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

二、解決的方法

將產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC22949接種于血平板上，經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)，待長(zhǎng)出明顯菌落，挑取單菌落于液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱FT），經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.延長(zhǎng)培養(yǎng)的時(shí)間。根據(jù)GB 8538-2016中的方法對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，將上述的FT培養(yǎng)液用0.85%的無(wú)菌生理鹽水連續(xù)梯度稀釋，配制成濃度分別為10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的菌懸液，分別吸取1mL稀釋后的菌懸液，加入到50mL的無(wú)菌天然飲用礦泉水中作為人工污染樣品。將不同濃度的樣品分別過(guò)0.22μm的濾膜，將濾膜緊貼于SPS培養(yǎng)基上，經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，不同濃度的菌懸液在SPS培養(yǎng)基上均未發(fā)現(xiàn)有生長(zhǎng)跡象。針對(duì)該情況，本試驗(yàn)延長(zhǎng)了培養(yǎng)時(shí)間，分別在36h、48h、60h、72h進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在48h后SPS培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，但不是標(biāo)準(zhǔn)要求的黑色菌落，而是灰色菌落，菌落數(shù)呈現(xiàn)梯度增長(zhǎng)趨勢(shì)。

挑取灰色菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)，結(jié)果表明，革蘭氏染色為陽(yáng)性粗大桿菌，在牛乳培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度極快，能夠分解乳糖產(chǎn)酸，將酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量的氣體，沖散酪蛋白，使其呈海綿狀，即“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，如圖1所示。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，硝酸鹽動(dòng)力試驗(yàn)無(wú)動(dòng)力（穿刺線周?chē)鷽](méi)有擴(kuò)散），硝酸鹽被還原變?yōu)榧t色，如圖2所示。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，卵黃培養(yǎng)基接種點(diǎn)的底部及周?chē)忻黠@的乳白色渾濁帶，如圖3所示。

2.增加活化的步驟。挑取生長(zhǎng)的菌落用FT培養(yǎng)后，再接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行確證試驗(yàn)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，直接挑取SPS生長(zhǎng)的菌落于FT培養(yǎng)基后，確證性試驗(yàn)結(jié)果不明顯，如硝酸鹽動(dòng)力試驗(yàn)不明顯，含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象不明顯?；诖?，試驗(yàn)中將FT培養(yǎng)液繼續(xù)接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。結(jié)果表明，再次被活化的菌在進(jìn)行確證試驗(yàn)時(shí)，硝酸鹽動(dòng)力試驗(yàn)無(wú)動(dòng)力（不擴(kuò)散）、硝酸鹽被還原變?yōu)榧t色;含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴沸”;卵黃培養(yǎng)基接種點(diǎn)的底部及周?chē)忻黠@的乳白色渾濁帶。

3.易被忽略的問(wèn)題。配制好的FT培養(yǎng)基在試驗(yàn)臨用前要隔水煮沸10min，以驅(qū)除培養(yǎng)基中溶解的氧氣。這一點(diǎn)往往會(huì)被許多實(shí)驗(yàn)者忽略，進(jìn)而影響到后續(xù)試驗(yàn)。采用未進(jìn)行煮沸的FT培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過(guò)程中不易觀察產(chǎn)氣現(xiàn)象;挑取菌落于煮沸后的FT培養(yǎng)基中，會(huì)觀察到明顯的氣泡不斷涌出，產(chǎn)氣現(xiàn)象明顯。

三、結(jié)論

產(chǎn)氣夾膜梭菌是一種厭氧菌，活力不同對(duì)試驗(yàn)結(jié)果會(huì)有不同的影響。（1）新購(gòu)入的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)活化后，在SPS培養(yǎng)基上24h后生長(zhǎng)出黑色菌落，且具有較強(qiáng)活力。（2）制成FT培養(yǎng)菌液，在4℃條件下放置2-3d后接種到SPS培養(yǎng)基，24h后無(wú)菌落生長(zhǎng);延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到48h-72h時(shí)，SPS平板上可觀察到菌落生長(zhǎng)，且顏色為灰色。（3）將放置的FT培養(yǎng)菌液重新接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再接種到SPS培養(yǎng)基，24h后生長(zhǎng)出黑色菌落。

綜上所述，若產(chǎn)氣夾膜梭菌活力較弱，按標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016的要求，24h內(nèi)可能不會(huì)生長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，在實(shí)際的試驗(yàn)過(guò)程中可以延長(zhǎng)產(chǎn)氣夾膜梭菌的培養(yǎng)時(shí)間，增加活化的步驟，以此來(lái)避免漏檢的可能性。