方文明，胡張捷，戴靈豪，劉 藝，王慧銘，王 輝

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是臨床上最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，主要病理特征是腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的進行性積累，后期造成腎小球、腎小管間質(zhì)纖維化［1?2］，腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化（tubular epithelial to mesenchymal transdifferentiation，TEMT）是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一，TGF?β／Smad 信號通路起了重要作用。在高糖狀態(tài)下，腎小管上皮細胞中TGF?β／Smad 信號通路激活可增加miR?21 的表達［3］，后者通過結(jié)合于靶mRNA 的3’UTR 端抑制張力蛋白同源的磷酸酯酶基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達，進一步刺激PI3K／Akt 通路從而激活下游激酶引起腎間質(zhì)肥大、細胞外基質(zhì)（ECM）異常沉積和足細胞凋亡［4］，表 明TGF?β1／miR?21／PTEN／PI3K／Akt 信號通路與DN 發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

中醫(yī)將糖尿病歸屬“消渴病”范疇，氣虛血瘀是其基本病機［5］，中藥復方具有多靶點、多途徑的特點，在防治DN 方面具有獨特的優(yōu)勢，臨床常用益氣活血法治療［6］。課題組前期證實，益氣活血方能有效改善DN［7］，本實驗在此基礎(chǔ)上考察該方是否通過調(diào)控TGF?β1／miR?21／PTEN／Akt 信號通路來改善血糖波動型GK 大鼠腎損傷，以期為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠，6 只，體質(zhì)量（250±20）g；SPF 級雄性自發(fā)性糖尿病大鼠，42 只，體質(zhì)量（250±20）g（GK 大鼠），均購自上海上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017?0005，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2018?0012。

1.2 藥物 門冬胰島素注射液（批號KVGY963?1，丹麥諾和諾德公司）；纈沙坦（批號H20170166，瑞士諾華制藥有限公司）均購自浙江省中醫(yī)院；25%葡萄糖注射液（批號20190808，德州京信藥業(yè)有限公司）。黃芪、川芎、葛根、生地黃、天花粉（批 號190402、190601、190602、190402、190601，產(chǎn)地甘肅、四川、安徽、河南、浙江，浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片公司），經(jīng)專家鑒定為正品。

1.3 儀器 血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護公司）；糖化血紅蛋白檢測儀（無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）；低溫高速離心機（美國Beckman，型號Allegra X?30R）；全自動血液生化分析儀（日本日立株式會所，型號7020）；包埋機（常州市雅博電子設(shè)備有限公司，型號YaBo 400）；切片機（型號RM2245）、倒置顯微鏡（型號DMI3000B）（德國Leica 公司）；A1CEZ2.0 糖化血紅蛋白檢測儀（江蘇省無錫市博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）；酶標儀（美國Thermo Scientific 公司，型號Multiskan MK3）；SDS?PAGE 電泳系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）；化學發(fā)光儀（美國Bio?Rad 公司，型號ChemiDoc XRS＋）。

1.4 試劑 血糖試紙（批號478811，羅氏血糖健康醫(yī)護公司）；糖化血紅蛋白檢測卡（批號020431，EKF?diagnostic GmbH）；miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）、miRNA 熒光定量PCR 試劑盒（染料法）、Trizol Reagent（批號B511311）（生工生物工程股份有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（批 號 L23J11G119324）、RIPA 裂解液（批 號L23J11G119326）、SDS?PAGE 凝膠配制試劑盒（批號L23J11G119323）（上海源葉生物科技有限公司）；β?actin ［批號8115914，博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g(shù)有限公司］；TGF?β1 兔單克隆抗體、PTEN兔單克 隆抗體、goat anti?rat IgG?HRP（批 號GR3252552?5、GR217474?9、GR3299244?2，英國Abcam 公司）；P?Akt（Ser473）兔單克隆抗體（批號25，美國CST 公司）；肌酐試劑盒、尿酸試劑盒、尿蛋白試劑盒、尿素氮試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒（批號20190821、20190821、20190821、20190810、20190810、20190821，南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 益氣活血方制備 益氣活血方組方藥材生黃芪24 g、川芎6 g、生地黃12 g、葛根12 g、天花粉6 g，大燒瓶中浸泡4 h（使水面高過藥物3 cm），第1 次10 倍量水回流提取2 h，第2 次8 倍量水回流提取1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1 g／mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模與分組 以Wistar 大鼠為正常組。GK大鼠適應性喂養(yǎng)后選取空腹血糖9.0 mmol／L 以上者造模，每天8：00、14：00 腹腔注射250 g／L 葡萄糖溶液0.375 mL／kg，8：30、14：30 皮下注射門冬胰島素注射液，每只1 U，造成1 d 中血糖值大幅度波動，連續(xù)6 周，于第3、6 周末測定9 個時間點（8：00、8：30、10：00、12：00、14：00、14：30、16：00、18：00、20：00）血糖波動情況。將造模大鼠隨機分為模型組、纈沙坦組、益氣活血方組，益氣活血方劑量根據(jù)臨床用量進行換算為每天8.3 g／kg，纈沙坦劑量為每天30 mg／kg，正常組、模型組大鼠以同容量生理鹽水灌胃，連續(xù)8 周。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般體征 每天觀察并記錄大鼠活動、精神狀態(tài)、毛發(fā)、排尿等情況。

2.3.2 體質(zhì)量 每周稱量并記錄1 次大鼠體質(zhì)量。

2.3.3 血糖波動監(jiān)測、給藥后空腹血糖及糖化血紅蛋白于當天8：00、8：30、10：00、12：00、14：00、14：30、16：00、18：00、20：00 測定并記錄血糖，繪制其波動趨勢圖。給藥后每周1 次對大鼠采用尾尖點刺出血法采血，血糖儀測定空腹血糖，第4、8 周末頜下靜脈采血，檢測糖化血紅蛋白。

2.3.4 生化指標 給藥8 周后，大鼠代謝籠收集尿液，3 500 r／min 離心15 min，留取上清液，測定尿肌酐、尿蛋白，計算24 h 尿蛋白排泄率，頜下靜脈取血，4 ℃下3 500 r／min 離心15 min，取血清，采用全自動血液生化分析儀檢測血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯水平。

2.3.5 腎臟指數(shù) 大鼠麻醉后迅速剖檢取雙側(cè)腎臟，生理鹽水洗滌血液并用干紙吸取水分，稱定質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)，公式為腎臟指數(shù)＝腎臟質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.3.6 PAS、HE 染色 將大鼠單側(cè)腎用多聚甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋切片，PAS、HE 染色，在光鏡下觀察腎臟組織病理變化。

2.3.7 大鼠腎臟組織miR?21 水平 采用TRIzol 兩步法抽提大鼠腎臟組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作，SYBR Green 法檢測miR?21 水平，以U6 為內(nèi)參（反應條件為95 ℃，10 min，95 ℃20 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，共循環(huán)40 次），2－△△Ct法計算表達量。miR?21 正向5′?GCGCGTAGCTTATCAGACTGA?3′，反 向 5′?AGTG CAGGGTCCGAGGTATT?3′；U6 正 向5′?TACAGAG AAGATTAGCATGGCCCT?3′，反向5′?AGTGCAGGG TCCGAGGTATT?3′。

2.3.8 大鼠腎臟組織TGF?β1、PTEN、P?Akt 蛋白表達 用高溫消毒剪刀剪取部分大鼠腎臟組織，將其粉碎并置于玻璃勻漿器中，加入適量裂解液，冰上研磨裂解30 min，12 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液，轉(zhuǎn)移于預冷的離心管中，BCA 法測定蛋白濃度后加上樣緩沖液煮沸變性，配制8%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣量20 μg，進行電泳、轉(zhuǎn)膜后TBST 洗膜3 次，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3 次，孵育一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，化學發(fā)光法顯影，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

2.4 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，方差不齊者采用Tamhane’s T2（M）法檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 一般體征 正常組大鼠反應敏捷，精神活躍，毛發(fā)柔順且有光；模型組大鼠較為暴躁，毛發(fā)雜亂；纈沙坦組、益氣活血方組大鼠均有一定程度的改善，毛發(fā)柔順，精神活躍。

3.2 體質(zhì)量 如圖1 所示，正常組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長，速度快于其他各組。從第12 周開始，與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.01），但2 組之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量Fig.1 Body weights of rats in various groups

3.3 血糖波動、空腹血糖、糖化血紅蛋白

3.3.1 血糖波動情況 如圖2 所示，Wistar 大鼠血糖水平在同一天內(nèi)均處于正常范圍；血糖波動型GK 大鼠在注射葡萄糖30 min 后血糖達到峰值，若注射胰島素則在150 min 內(nèi)降至最低值，14：00 時基本恢復到正常水平，再注射葡萄糖、胰島素后20：00 時亦然，同一天內(nèi)形成2 次血糖高峰與低谷，而且在造模第6 周時注射胰島素后血糖值高于第3 周時，表明其胰島素抵抗更嚴重。

圖2 大鼠血糖波動情況Fig.2 Blood glucose fluctuation conditions of rats

3.3.2 空腹血糖 如圖3 所示，給藥第6 周時，與模型組比較，益氣活血方組大鼠空腹血糖水平降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠空腹血糖水平Fig.3 FBG levels in rats in various groups

3.3.3 糖化血紅蛋白 如圖4 所示，與正常組比較，模型組糖化血紅蛋白水平升高（P＜0.01）；給藥第4 周時，與模型組比較，益氣活血方組、纈沙坦組糖化血紅蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）；在給藥第8 周時，益氣活血方組糖化血紅蛋白水平降低（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠糖化血紅蛋白水平Fig.4 Glycosylated hemoglobin levels in rats in various groups

3.4 生化指標

3.4.1 尿肌酐、24 h 尿蛋白排泄率 如圖5 所示，與正常組比較，模型組大鼠尿肌酐水平、24 h 尿蛋白排泄率升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠尿肌酐水平、24 h 尿蛋白排泄率降低（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠尿肌酐水平、24 h 尿蛋白排泄率Fig.5 Urinary creatinine levels and 24 h urinary protein excretion rates in rats in various groups

3.4.2 血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯 由表1 可知，與正常組比較，模型組大鼠血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯水平降低（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯水平（， n＝6）Tab.1 Serum urea nitrogen，uric acid，total cholesterol and triglyceride levels in rats in various groups（， n＝6）

表1 各組大鼠血清尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯水平（， n＝6）Tab.1 Serum urea nitrogen，uric acid，total cholesterol and triglyceride levels in rats in various groups（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.5 腎臟指數(shù) 如圖6 所示，與正常組比較，模型組大鼠腎臟指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠腎臟指數(shù)降低（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠腎臟指數(shù)Fig.6 Renal indices of rats in various groups

3.6 腎臟組織PAS、HE 染色 如圖7～8 所示，正常組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，形狀規(guī)則；模型組大鼠腎小球萎縮，基底膜增厚，細胞外基質(zhì)積聚，系膜擴張，細胞形態(tài)改變；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠腎臟組織病理改變程度均有所改善。

圖7 各組大鼠腎臟切片PAS 染色（×400）Fig.7 PAS staining of renal sections of rats in various groups（×400）

3.7 腎臟組織miR?21 表達 如圖9 所示，與正常組比較，模型組大鼠miR?21 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠miR?21 表達降低（P＜0.01），以纈沙坦組更優(yōu)。

圖8 各組大鼠腎臟切片HE 染色（×400）Fig.8 HE staining of renal sections of rats in various groups（×400）

圖9 各組大鼠腎臟組織中miR?21 表達Fig.9 Expressions of miR?21 in renal tissues of rats in various groups

3.8 TGF?β1、PTEN、P?Akt 蛋白表達 如圖10所示，與正常組比較，模型組大鼠TGF?β1、P?Akt表達升高（P＜0.01），PTEN 表 達降低（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、益氣活血方組大鼠TGF?β1、P?Akt 表達降低（P＜0.01），PTEN表達升高（P＜0.01）。

圖10 各組大鼠腎臟組織TGF?β1、PTEN、P?Akt 表達Fig.10 Expressions of TGF?β1，PTEN and p?Akt in renal tissues of rats in various groups

4 討論

DN 是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病機制復雜，近年來，DN 發(fā)病率逐年上升，逐漸成為終末期腎?。‥SRD）和腎功能衰竭的首要誘因（約占35%）［8］，嚴重威脅人類健康。而血糖波動是引起糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵因素，近年研究表明波動性血糖對患者并發(fā)癥和死亡率的影響遠大于穩(wěn)定性高血糖，且波動越大，并發(fā)癥發(fā)生率越高、預后越差［9?11］。前期研究結(jié)果表明血糖波動可以加重GK大鼠的腎臟病變［12］，本課題組研究證實益氣活血方能改善大鼠的腎臟病變，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上探究益 氣活血 方是否通過TGF?β1／miR?21／PTEN／Akt 信號通路保護血糖波動型GK 大鼠腎臟損傷，結(jié)果表明給藥8 周后可以改善糖尿病大鼠的癥狀，降低空腹血糖、尿肌酐、24 h 尿蛋白排泄率、尿素氮、尿酸、總膽固醇、甘油三酯及腎臟指數(shù)，從病理切片結(jié)果說明益氣活血方可以改善腎小球損傷及基底膜增厚等病理變化。

TGF?β1 是一種多效性的細胞因子，具有強大的調(diào)節(jié)功能。TGF?β1 信號通路在DN 中被激活，TGF?β1 的抑制可減輕糖尿病動物模型中的腎纖維化。TGF?β1 促進纖維化的機制是多因素的，包括促進ECM 過度表達、減少ECM 降解、增強膠原和彈性蛋白纖維之間的交聯(lián)以及過度激活近端小管和內(nèi)皮細胞分化［13?15］。實驗結(jié)果表明益氣活血方可以降低TGF?β1 的表達量，這可能是其改善腎臟損傷的作用機制。microRNA 是基因組的有力調(diào)節(jié)劑，整體表達譜分析顯示miR?21 是與糖尿病腎病中相關(guān)性最高的microRNA 之一［16］。miR?21 在正常腎組織中很少表達，卻在人類及動物的急性及慢性腎病模型中高表達，尤其在糖尿病大鼠模型的腎小球及腎小管間質(zhì)組織中呈明顯上調(diào)趨勢，在缺血／再灌注的腎組織中表達豐度也顯著升高［17?18］。有研究表明TGF?β1 誘導的系膜細胞miR?21 的表達量顯著升高［19］，本研究也證實模型組大鼠miR?21 的表達量升高，通過益氣活血方干預后可以降低miR?21 表達。

有研究表明沉默miR?21 可提高PTEN 的蛋白表達，足細胞中PTEN 的下調(diào)會導致肌動蛋白動力學失調(diào)，從而促進足突消失和蛋白尿，PTEN 功能降低導致PI3K／Akt 過度激活，PI3K／Akt 信號通路的異常激活可觸發(fā)了下游相關(guān)的各種酶和轉(zhuǎn)錄因子。PI3K／Akt 信號通路的激活間接導致α?平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白Ⅳ的增多，并促進DN 的進展［20?22］。本項研究表明益氣活血方可以升高PTEN的表達并且降低P?Akt 的表達。

綜上所述，益氣活血方可以保護血糖波動型GK 大鼠的腎臟組織，延緩疾病發(fā)展進程，這可能與其通過TGF?β1／miR?21／PTEN／Akt 信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究為益氣活血方進一步在臨床上的應用提供實驗基礎(chǔ)和理論支持，同時也為糖尿病腎病提供了新的治療策略。