張群鑠譚紅勝 付文衛(wèi)尚宇婧徐宏喜*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203； 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

單純性皰疹是單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）所引起的一種急性皰疹性皮膚病，此病毒終生感染宿主，可引起從簡(jiǎn)單的口腔和外生殖器潰瘍到非常嚴(yán)重的腫瘤和腦炎等一系列疾?。?］。目前臨床上的治療藥物以阿昔洛韋等核苷類抗病毒藥物為主，但由于長(zhǎng)期大量的使用，臨床已產(chǎn)生耐藥病毒株［2］。因此，開發(fā)具有新型抗病毒作用機(jī)制的藥物來取代或者輔助洛韋類用藥迫在眉睫。

徐宏喜等［3?5］對(duì)300 多種中藥進(jìn)行了系統(tǒng)的抗病毒篩選，首次報(bào)道夏枯草水提物具有體外抗HSV?1 活性，繼而對(duì)夏枯草多糖進(jìn)行了抗HSV 活性的導(dǎo)向分離，獲得了分子量分別3 500 和8 500 的2 個(gè)多糖組分，初步化學(xué)研究顯示為木質(zhì)素多糖復(fù)合物；用夏枯草提取物制備的凝膠制劑，體內(nèi)豚鼠動(dòng)物模型（HSV?1）及小鼠動(dòng)物模型（HSV?2）均有活性，且無細(xì)胞毒性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖通過阻止病毒吸附和穿透進(jìn)入宿主細(xì)胞而發(fā)揮作用，作用機(jī)制與阿昔洛韋的直接殺滅病毒不同［6?12］。

目前，多數(shù)文獻(xiàn)將夏枯草水提醇沉部分默認(rèn)為夏枯草多糖，其分離方法也多以提高多糖純度為目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)將夏枯草酶解提取液用乙醇梯度沉淀分段，以抗HSV 活性為導(dǎo)向，嘗試尋找夏枯草抗HSV 活性組分，分析各部分成分組成，以期為進(jìn)一步探尋夏枯草抗HSV 復(fù)合多糖構(gòu)效關(guān)系提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

夏枯草（批號(hào)2018052102）購(gòu)自上海華鷹藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室張紅梅副教授鑒定為正品。纖維素酶（批號(hào)64001136）、D?葡萄糖（批號(hào)101330576）、沒食子酸（批號(hào)20180710）、考馬斯亮藍(lán)G?250、無水碳酸鈉、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、磷酸，均購(gòu)自上海國(guó)藥試劑有限公司；牛血清蛋白（批號(hào)Exp2019103）購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；磷鉬鎢酸試液（上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司）；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒CCK8（上海李記生物科技有限公司）。

Vero 非洲綠猴腎細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫，貨號(hào)CCL?81；10%胎牛血清100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素（美國(guó)Hyclone 公司）；2 mM L?谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉、DMEM 培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco 公司）。

HSV?1 GHSV?UL46 株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫，貨號(hào)VR?1544。

粉碎機(jī)、冷凍干燥機(jī)（Alpha 2?4 LDplus CHRTST）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10DS25 IKA）；CP225D 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；centrifuge 5810R 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SK7200HP 超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（Mapapa P3）；酶標(biāo)儀SpectraMax M2e（美國(guó)Molecular Device 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏枯草酶解水提物分級(jí)醇沉 取夏枯草果穗，粉碎過2 號(hào)篩，取100 g 粉末，加5 g 纖維素酶混勻，加10 倍水于50 ℃攪拌3 h，迅速升溫至100 ℃滅活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得濾液合并濃縮后，依次用20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇醇沉，醇沉液于4 ℃靜置12 h 后，4 000 r／min 離心30 min，取沉淀冷凍干燥得各分級(jí)醇沉部分（依次為 PVLM?1、PVLM?2、PVLM?3、PVLM?4、PVLM?5、PVLM?6）

2.2 抗HSV?1 活性測(cè)試 CPE（cytopathic effect）指病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的現(xiàn)象，通過檢測(cè)細(xì)胞活力，CPE 實(shí)驗(yàn)被廣泛用于化合物對(duì)可引起細(xì)胞病變的病毒的抑制活性測(cè)定［13］。本研究應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)，采用Vero 細(xì)胞、GHSV?UL 46 病毒株、CCK8 檢測(cè)試劑、Acyclovir 陽性對(duì)照，化合物處理5 d／終點(diǎn)法，檢測(cè)受試樣品對(duì)HSV?1 的體外抑制活性。

將Vero 細(xì)胞以每孔10 000 個(gè)細(xì)胞的濃度接入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天分別加入受試樣品／陽性對(duì)照化合物和病毒（MOI ＝0.02）。細(xì)胞培養(yǎng)液中的DMSO 終濃度為0.5%。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d 至病毒對(duì)照孔（細(xì)胞感染病毒，無化合物處理）內(nèi)細(xì)胞病變率達(dá)到80%～95%。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與抗病毒實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)條件一致，但無病毒感染。

使用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力。受試樣品的抗病毒活性和細(xì)胞毒性分別由受試樣品對(duì)病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制率和細(xì)胞活率表示。計(jì)算公式如下。

使用GraphPad Prism（version 5）軟件對(duì)受試樣品的抑制率和細(xì)胞活率進(jìn)行非線性擬合分析，得到受試樣品的EC50和CC50值。

結(jié)果顯示，受試樣品PVLM?1、PVLM?2、PVLM?6 對(duì)HSV?1 具有抑 制活性，EC50值分別 為60.79、42.45、101.70 μg／mL；其他受試樣品在測(cè)試濃度內(nèi)沒有顯示出抗病毒活性，EC50值為大于最高檢測(cè)濃度＞250 μg／mL。

受試樣品在測(cè)試濃度內(nèi)對(duì)Vero 細(xì)胞沒有顯示出細(xì)胞毒性，CC50值為大于最高檢測(cè)濃度＞250 μg／mL。見表1。

表1 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀抗HSV?1 活性（μg／mL）

2.3 成分分析 結(jié)果見表2。

表2 夏枯草酶解水提物各梯度乙醇沉淀成分組成（%）

2.3.1 多糖含量測(cè)定 采用硫酸?苯酚法［14］，以葡萄糖為對(duì)照品，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程A＝24.674X－0.3462（r＝0.999 0），在5.034～50.34 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法［15］，以牛血清蛋白為對(duì)照品，于595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程A＝22.611X－0.259 7（r＝0.997 4），在1.687～16.867 μg／ mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 多酚含量測(cè)定 采用Folin?Ciocalteu 法［16］，以沒食子酸為對(duì)照品，在760 mn 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程A＝10.048X－0.009 8（r＝0.999 9），在2.08～20.80 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 夏枯草酶解水提液30%醇沉部分多糖的純化及其活性測(cè)試

2.4.1 夏枯草抗HSV 活性部位制備 取夏枯草果穗，粉碎過篩，取粉末100 g，加5 g 纖維素酶混勻，加10 倍水于50 ℃攪拌3 h，迅速升溫至100 ℃滅活，加10 倍水煎煮2次，每次1.5 h，所得濾液合并濃縮后，加無水乙醇至醇濃度30%，于4 ℃靜置12 h 后，4 000 r／min 離心30 min，取沉淀冷凍干燥，即得。

2.4.2 柱色譜前處理 大孔樹脂D301 用95% 乙醇浸泡12 h后濕法裝柱，用95% 乙醇沖洗層析柱（體積流量2 BV／ h，BV 為樹脂體積數(shù)，下同），至流出液加2 倍蒸餾水后不產(chǎn)生渾濁為止，再用大量蒸餾水洗至流出液澄清，繼續(xù)洗脫2～3 BV；HCl 溶液洗層析柱（體積流量4～6 BV／h），并浸泡2～3 h，再用蒸餾水以同樣的體積流量洗至中性，用2～3 BV 4%NaOH 溶液洗層析柱（體積流量4～6 BV／h），浸泡2～3 h 后，再用蒸餾水以同樣的體積流量洗至中性。

2.4.3 柱色譜純化過程 取“2.4.1”項(xiàng)下夏枯草抗HSV活性部位適量，制備成質(zhì)量濃度為0.3 mg／mL 的上樣液，以料液?填料1 ∶50 的比例上樣，首先用蒸餾水作流動(dòng)相，5 mL 為一流分，用自動(dòng)接收器接收，每一流分用濃硫酸?5%苯酚進(jìn)行顯色，收集顯色者，濃縮，凍干，進(jìn)行含量測(cè)定及抗HSV?1 活性檢測(cè)。再用1 mol／L NaCl 溶液作流動(dòng)相，以5 mL 為一流分，用自動(dòng)接收器接收，每一流分用濃硫酸?5%苯酚進(jìn)行顯色，收集顯色者，3 kD 超濾離心管離心，1% AgCl 溶液檢測(cè)，去除NaCl 至無沉淀產(chǎn)生，凍干，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖、蛋白質(zhì)、多酚含量，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行體外抗HSV?1 活性檢測(cè)。結(jié)果見表3。

表3 夏枯草多糖及其他成分含量、活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

纖維素酶解可通過酶水解破碎植物細(xì)胞壁的作用，使細(xì)胞內(nèi)多糖物質(zhì)充分溶出，從而提高藥用成分的提取率［16?17］。纖維素酶水解過程中應(yīng)注意溫度不能過高，酶解后需立即升溫滅活。應(yīng)用CPE 試驗(yàn)，對(duì)夏枯草酶解水提液各梯度乙醇沉淀進(jìn)行抗HSV 活性篩選，發(fā)現(xiàn)20% 及30%乙醇的沉淀具有良好的抗HSV?1 活性，其ED50分別為60.79、42.45 μg／mL，40%乙醇及以上的分級(jí)沉淀無活性或有較弱的活性；經(jīng)大孔樹脂D301 純化后的夏枯草多糖，純度可達(dá)77.78%，但其抗HSV 活性反而喪失。通過對(duì)各部分分級(jí)醇沉及經(jīng)大孔樹脂D301 純化后的夏枯草多糖進(jìn)行各類成分分析發(fā)現(xiàn)，多糖含量的高低與其抗HSV 活性強(qiáng)弱并不呈現(xiàn)正相關(guān)，反而蛋白質(zhì)及多酚類成分的去除會(huì)消除相應(yīng)成分的抗HSV 活性，其構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步探究。