帖曉燕,馮銀平,張?jiān)弃Q,楊錫倉(cāng),李 蕓*,胡芳弟
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅蘭州730000; 2.蘭州大學(xué),甘肅蘭州730000; 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000)
黨參為桔??浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.、素花黨參C.pilosula Nannf.var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen 或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根[1],具健脾益肺、養(yǎng)血生津之功效。黨參氣味甘、平,生用長(zhǎng)于益氣生津、氣血雙補(bǔ),米炒后氣變清香,和胃、健脾止瀉作用增強(qiáng),用于脾胃虛弱,食少,便溏等,清·《時(shí)病論》 曰“黨參……米炒,治脾土虛寒泄瀉”[2]。目前,黨參米炒健脾止瀉物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。黨參主要含有有多炔類、苯丙素類、三萜類、糖類、生物堿類等多種成分,現(xiàn)代藥理研究表明,黨參具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)兊人幚碜饔茫??4]。黨參炔苷為黨參的主要活性成分之一,為聚乙炔類化合物,對(duì)乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護(hù)作用,具有明顯的抗?jié)冏饔茫?]。目前,黨參炔苷還沒有成為《中國(guó)藥典》 作為黨參質(zhì)量控制的主要指標(biāo),有望將來能實(shí)現(xiàn)。
本實(shí)驗(yàn)以渭源會(huì)川產(chǎn)的黨參(白條黨)為研究對(duì)象,通過熱浸法、HPLC 法研究黨參米炒前后醇溶性浸出物、黨參炔苷含量的變化,以番瀉葉瀉下和番瀉葉加勞倦過度2 種方法復(fù)制小鼠脾虛泄瀉模型,對(duì)比研究黨參米炒前后健脾止瀉藥效變化,進(jìn)一步證實(shí)黨參米炒后健脾止瀉作用增強(qiáng)的科學(xué)、合理性,初步探討基于黨參炔苷炮制前后變化闡述健脾止瀉功效變化之炮制機(jī)制,以期為臨床選用恰當(dāng)?shù)呐谥破诽峁﹨⒖肌?/p>
1.1 藥物與試劑 黨參采自甘肅省渭源縣會(huì)川鎮(zhèn),經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任中藥師鑒定為桔??浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.的干燥根。黨參炔苷對(duì)照品(成都克洛瑪生物科技有限公司,批號(hào)CHB150815,HPLC≥98.00%)。蒙脫石散(山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)1803004)。番瀉葉(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院);淀粉酶(AMS)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)。乙腈、甲醇均為色譜純;45%乙醇為分析純,水為純凈水。
1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明小鼠,體質(zhì)量18~22 g,雌雄各半,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2015?0001。
1.3 儀器 Agilent 1100 Series 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);DAD 檢測(cè)器UV?3300(上海美譜達(dá)儀器有限公司);KQ?500DE 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FW?400A 高建萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司);SHB?ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);BT125D 型電子天平(1∕10 萬,美國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);DHG?9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);HHS?11S 數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠);BC?2800Vet 型獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。
2.1 黨參的炮制
2.1.1 生品 將藥材去除雜質(zhì),洗凈,泡15~20 min(水沒過藥面),悶潤(rùn)3 h,切制成2~4 mm 的厚片,于50 ℃下干燥[6],取出備用,炮制3 批。
2.1.2 米炒品 取藥材飲片,用米拌炒至表面深黃色,取出,篩去米,放涼(每100 kg 黨參用大米20 kg)備用[1],炮制3 批,得率85.2%,該過程由“隴原工匠”楊錫倉(cāng)老師指導(dǎo)完成。
2.2 黨參米炒前后浸出物測(cè)定 取生品、米炒品粉末(過3 號(hào)篩)各約2.0 g,精密稱定,按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部(通則2201),加45%乙醇,以熱浸法進(jìn)行測(cè)定,每批樣品平行3 份。
2.3 黨參米炒前后黨參炔苷含量測(cè)定
2.3.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈?水(22 ∶78);體積流量1.0 mL∕min;檢測(cè)波長(zhǎng)269 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。
圖1 黨參炔苷HPLC 色譜圖
2.3.2 對(duì)照品貯備液制備 取黨參炔苷對(duì)照品2.90 mg,精密稱定,加甲醇制成每1 mL 含0.29 mg 的溶液,即得。
2.3.3 供試品溶液制備 取生品、米炒品粉末(過3 號(hào)篩)約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(250 W,33 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液2 mL,置10 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4 方法學(xué)考察
2.3.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品貯備液0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL,置5 mL 量瓶中,加入甲醇定容,搖勻,制成質(zhì)量濃度為14.5、29.0、58.0、87.0、116.0、145.0 μg∕mL 的系列工作溶液,連同貯備液在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸。
2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 量取對(duì)照品貯備液,在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次,依法測(cè)定。
2.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(第2 批),按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。
2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(第2 批)溶液,于0、2、4、6、8、12、24、72 h 在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。
2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取1.0 g 成分含量已知(1.15 mg∕g)的樣品(第2 批)6 份,精密稱 定,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并精密加入已知質(zhì)量濃度的黨參炔苷對(duì)照品溶液各4 mL,在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,計(jì)算回收率。
2.3.4.6 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取生品、米炒品各3批,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,計(jì)算含量。
2.4 黨參米炒前后脾虛泄瀉小鼠的藥效對(duì)比
2.4.1 番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠模型的復(fù)制 將KM 小鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,陽(yáng)性組,黨參和米炒黨參高、中、低劑量組,每組6 只。除空白組外,其余各組采用苦寒瀉下法復(fù)制脾虛泄瀉模型[7],具體方法為造模組小鼠灌胃給予12%番瀉葉水煎液0.5 mL∕只,每日1 次,連續(xù)10 d;空白組常規(guī)飼養(yǎng)。
模型復(fù)制成功后,陽(yáng)性組灌胃給予1.17 g∕kg 的蒙脫石散,黨參和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予15.6、7.8、3.9 g∕kg 相應(yīng)劑量水提物,空白組和模型組小鼠灌胃給予等劑量的蒸餾水,每日1 次,連續(xù)6 d。給藥期間除空白組外,其余各組持續(xù)造模。
2.4.2 番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠模型的復(fù)制 將KM 小鼠隨機(jī)分為空白組,模型組,陽(yáng)性組,黨參和米炒黨參高、中、低劑量組,每組6 只,除空白組外,其余各組采用“苦寒瀉下法+勞倦過度”復(fù)合因素造模方法復(fù)制脾虛泄瀉模型[8],具體方法為造模組小鼠灌胃給予100%番瀉葉水煎液(0.5 mL∕只),并置于(25±1)℃、水深50 cm的游泳缸中負(fù)重游泳至力竭,以身體下沉為度,每日1 次,連續(xù)7 d;空白組常規(guī)飼養(yǎng)。
模型復(fù)制成功后,陽(yáng)性組灌胃給予1.17 g∕kg 的蒙脫石散,黨參和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予15.6、7.8、3.9 g∕kg 相應(yīng)劑量水提物,空白組和模型組小鼠灌胃給予等劑量的蒸餾水,每日1 次,連續(xù)6 d。給藥期間除空白組外,其余各組持續(xù)造模。
2.4.3 血常規(guī)檢測(cè) 給藥前1 d,小鼠禁食不禁水12 h后,眼眶靜脈叢采血,迅速用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)。
2.4.4 一般情況觀察 分別觀察各組小鼠造模前后及給藥治療后的一般狀態(tài),包括體質(zhì)量、進(jìn)食量、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、大便、是否脫肛等。
2.4.5 小鼠血清AMS、LDH 水平測(cè)定 末次給藥24 h 后,小鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.2 mL∕20 g)進(jìn)行麻醉,股動(dòng)脈取血,靜置30 min 后3 500 r∕min 離心15 min,吸取上層血清,按照實(shí)際和說明書要求應(yīng)用比色法測(cè)定AMS、LDH 水平。
2.4.6 小鼠免疫器官胸腺、脾臟指數(shù)的測(cè)定 記錄末次給藥24 h 后小鼠體質(zhì)量,脫頸椎處死,取脾臟和胸腺,用濾紙吸干臟器表面血污,分別稱定質(zhì)量,計(jì)算脾臟及胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)(mg∕g)=臟器質(zhì)量(mg)∕體質(zhì)量(g)。
2.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以()表示,組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 黨參米炒前后浸出物測(cè)定 黨參米炒后,醇溶性浸出物明顯降低,見圖2。
圖2 黨參、米炒黨參醇浸出物測(cè)定結(jié)果
3.2 方法學(xué)考察 黨參炔苷回歸方程為Y=4 078.4X-5.402 3(r=0.999 8),在14.5~290.0 μg∕mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)中黨參炔苷峰面積RSD 為1.70%,表明儀器精密度良好;重復(fù)性試驗(yàn)中黨參炔苷含量RSD 為1.20%,表明該方法重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗(yàn)中黨參炔苷峰面積RSD 為2.66%,表明溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好;平均加樣回收率為103.20%,RSD 為2.48%,見表1。黨參米炒前后黨參炔苷含量基本無變化,見表2。
表1 黨參炔苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
表2 黨參炔苷含量測(cè)定結(jié)果
3.3 對(duì)番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠的健脾止瀉作用
3.3.1 對(duì)小鼠血常規(guī)檢測(cè)的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合血常規(guī)中的白細(xì)胞數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板壓積(PCT)、血紅蛋白(HGB)等綜合判斷脾虛證小鼠模型是否復(fù)制成功。與空白組比較,血小板計(jì)數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。
表3 小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(Ⅰ,, n=6)
表3 小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(Ⅰ,, n=6)
注:與空白組比較,#P<0.05。
3.3.2 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較,模型組小鼠進(jìn)食量下降,皮毛松散,無光澤,便軟不成形,體質(zhì)量下降(P<0.01);與模型組比較,米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質(zhì)量升高(P<0.05,P<0.01),黨參高劑量組有升高的趨勢(shì)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與同劑量黨參組比較,米炒黨參高劑量組小鼠的體質(zhì)量升高(P<0.05)。表明黨參和米炒黨參對(duì)番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠體質(zhì)量有改善作用,且米炒黨參效果更佳,見圖3。
圖3 黨參、米炒黨參水提物對(duì)番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠體質(zhì)量的影響
3.3.3 對(duì)小鼠AMS、LDH 水平的影響 與空白組比較,模型組小鼠AMS、LDH 水平顯著降低(均P<0.01);與模型組比較,黨參高劑量組和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠AMS 水平均升高,米炒黨參高劑量組較明顯(P<0.01),并能升高LDH 水平(P<0.01);與同劑量黨參組比較,米炒黨參高、中、低劑量組小鼠AMS 水平升高(P<0.05,P<0.01),米炒黨參高劑量組小鼠LDH 水平升高(P<0.05),表明黨參及米炒黨參對(duì)番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠AMS 和LDH水平均有升高作用,以米炒品更為顯著,見圖4。
3.3.4 對(duì)臟器指數(shù)的影響 與空白組比較,模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性組、米炒黨參高劑量組和黨參高劑量組脾臟指數(shù)升高(P<0.05,P<0.01),黨參中劑量組、米炒黨參高、中劑量組胸腺指數(shù)均升高(P<0.05,P<0.01);與同劑量黨參組比較,米炒黨參高、中、低劑量組脾臟指數(shù)升高(P<0.01),米炒黨參高、低劑量組胸腺指數(shù)升高(P<0.01),表明黨參及米炒黨參對(duì)脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺均有保護(hù)作用,以米炒品更佳,見圖4。
3.4 對(duì)番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠的健脾止瀉作用
3.4.1 對(duì)小鼠血常規(guī)檢測(cè)的影響 與空白組比較,PLT、PCT 降低(P<0.05,P<0.01),表明造模成功,見表4。
表4 小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(Ⅱ,, n=6)
表4 小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果(Ⅱ,, n=6)
注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01。
3.4.2 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較,模型組小鼠進(jìn)食量下降,畏寒、蜷臥少動(dòng),游泳耐力下降,皮毛松散,無光澤,便軟不成形,體質(zhì)量下降(P<0.01);與模型組比較,米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質(zhì)量升高(P<0.05,P<0.01),黨參高、中劑量組有升高趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與同劑量黨參組比較,米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質(zhì)量升高(P<0.05),表明黨參和米炒黨參對(duì)番瀉葉瀉下加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠體質(zhì)量有改善作用,以米炒黨參更佳,見圖5。
圖5 黨參、米炒黨參水提物對(duì)番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠體質(zhì)量的影響
3.4.3 對(duì)小鼠AMS、LDH 水平的影響 與空白組比較,模型組小鼠AMS、LDH 水平均降低(均P<0.01);與模型組比較,黨參高劑量組和米炒黨參高劑量組小鼠AMS 均升高,以米炒黨參高劑量組更明顯(P<0.01),并能升高LDH 水平(P<0.01);與同劑量黨參組比較,米炒黨參中劑量組小鼠LDH 水平升高(P<0.05),表明黨參及米炒黨參對(duì)番瀉葉瀉下加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠AMS 和LDH 水平均有升高作用,以米炒品更為顯著,見圖6。
圖6 黨參、米炒黨參水提物對(duì)番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠AMS、LDH 活性及臟器指數(shù)的影響
3.4.4 對(duì)臟器指數(shù)的影響 與空白組比較,模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低(均P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性組和米炒黨參高劑量組脾臟指數(shù)升高(P<0.01),米炒黨參高、中劑量組胸腺指數(shù)均升高(P<0.05,P<0.01);與同劑量黨參組比較,米炒黨參高、中劑量組脾臟指數(shù)升高(P<0.01,P<0.05),米炒黨參中劑量組胸腺指數(shù)升高(P<0.01),表明黨參及米炒黨參對(duì)脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺均有保護(hù)作用,以米炒品更佳,見圖6。
米炒黨參是《中國(guó)藥典》 收載的黨參的唯一一個(gè)炮制品。黨參米炒后醇溶性浸出物明顯降低,推測(cè)可能與米炒后黨參所含揮發(fā)油及萜類成分部分揮發(fā)、部分被米吸附,且該兩類成分均溶于乙醇有關(guān)。劉海萍等[9]通過GC?MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)黨參米炒前后揮發(fā)性成分進(jìn)行比較就發(fā)現(xiàn)黨參米炒后揮發(fā)油含量降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,黨參米炒前后黨參炔苷含量基本無變化,這可能就是黨參米炒前后均具有補(bǔ)脾氣作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。黨參炔苷對(duì)乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護(hù)作用,其抗胃黏膜急性損傷的機(jī)制之一可能為提高胃黏膜內(nèi)前列腺素(PG)的含量,從而對(duì)抗胃泌素的泌酸作用,刺激胃黏膜合成釋放表皮生長(zhǎng)因子[10],與黨參補(bǔ)中益氣的傳統(tǒng)功效相符。
本實(shí)驗(yàn)基于單因素和復(fù)合因素造模來比較2 種造模方法的優(yōu)劣,采用番瀉葉瀉下法、番瀉葉瀉下加勞倦過度2種方法復(fù)制小鼠脾虛泄瀉模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,番瀉葉致脾虛泄瀉和番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉2 個(gè)模型對(duì)體重、PCT 及PLT 含量的影響均表現(xiàn)為下降,表明脾虛泄瀉模型復(fù)制成功,且番瀉葉加勞倦過度法對(duì)造模小鼠體征及血液方面的影響較番瀉葉造模更為明顯,表明造模以復(fù)合因素為優(yōu)。
AMS 是一種重要的消化酶,主要由唾液腺和胰腺分泌,淀粉酶分泌不足,機(jī)體的消化功能必然受到影響。LDH 是一種糖酵解酶,是消耗的葡萄糖是否通過需氧或無氧糖酵解轉(zhuǎn)化為能量的重要決定因素[11]。本研究發(fā)現(xiàn)脾虛泄瀉可致血清中AMS、LDH 水平降低,提示脾虛泄瀉可伴有AMS、LDH 分泌異常,米炒黨參治療后對(duì)AMS、LDH 分泌有逆轉(zhuǎn)作用,這表明其對(duì)脾虛泄瀉證的治療作用之一可能是通過影響血液中的AMS、LDH 水平實(shí)現(xiàn)的。
臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo),脾臟及胸腺指數(shù)的改變可直觀反映機(jī)體及細(xì)胞免疫水平的變化。本研究結(jié)果顯示,米炒黨參能顯著增加脾虛泄瀉小鼠的脾臟及胸腺指數(shù),對(duì)機(jī)體有很好的免疫保護(hù)作用,且黨參多糖是增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的主要生物活性成分[12],黨參中的免疫活性成分可能通過調(diào)控腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、白細(xì)胞介素?10(IL?10)、白細(xì)胞介素?6(IL?6)等靶點(diǎn),T 細(xì)胞受體信號(hào)通路,NOD 樣受體信號(hào)通路等多個(gè)途徑發(fā)揮增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[13]。
綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黨參及米炒黨參可升高脾虛泄瀉小鼠AMS、LDH、脾臟和胸腺指數(shù)水平,從而減輕脾虛泄瀉癥狀,且米炒黨參健脾止瀉作用更為顯著,推測(cè)其功效增強(qiáng)的原因可能為黨參米炒后得率為85%,按照“齊同對(duì)比”原則,同等劑量的黨參和米炒黨參藥效對(duì)比,米炒黨參組的給藥量相對(duì)黨參而言增加15%,因此藥效有增強(qiáng)趨勢(shì);輔料大米氣味甘、平,具補(bǔ)中益氣、健脾和胃、止瀉痢等功效,與黨參共炒后,氣變清香,醒脾開胃作用增強(qiáng);黨參米炒后,產(chǎn)生了與健脾止瀉作用相關(guān)的化學(xué)成分,具體變化有望在后續(xù)采用LC?MS 進(jìn)一步研究。
致謝:衷心感謝閆治攀主管中藥師,燕玉奎師兄、馬駿、周尚儒、姚懿芹在實(shí)驗(yàn)期間給予的幫助。