李雪梅，白穎鋒，杭愛(ài)武，陸兔林，毛春芹

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，在參與體內(nèi)物質(zhì)的儲(chǔ)存、合成、吸收和代謝過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。因此，肝系疾病和肝損傷會(huì)嚴(yán)重威脅到人類的健康，而迫切找到能安全有效地阻斷或逆轉(zhuǎn)肝損傷的新療法成為醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重中之重。具有中國(guó)傳統(tǒng)文化特色的中醫(yī)藥在臨床治療過(guò)程中有著巨大的潛力，其臨床治療廣泛性及安全性更是優(yōu)勢(shì)所在，在當(dāng)代，具有保肝護(hù)肝作用的中藥及其復(fù)方和制劑不乏其用。

中醫(yī)辨肝損傷，以見(jiàn)其兩脅作痛或脅下癥瘕，口苦，胸悶，納差，身目發(fā)黃等癥狀作為診斷依據(jù)，來(lái)指導(dǎo)臨床遣方用藥。芍藥甘草湯作為柔肝緩急止痛的基本方，出自《傷寒雜病論·辨太陽(yáng)病脈證并治》，是張仲景為治療傷寒夾虛誤汗亡陽(yáng)，陽(yáng)復(fù)厥愈足溫后腳攣急而設(shè)［1］，僅由白芍、甘草2 味藥配伍而成，為酸甘化陰，調(diào)肝理脾之代表方。方中白芍酸寒，入肝、脾經(jīng)，功善斂肝陰以養(yǎng)血，調(diào)理肝脾，柔肝止痛；甘草味甘性平，善緩急止痛，能入中焦而具有補(bǔ)脾益氣之力。兩藥相伍，益陰斂陽(yáng)，調(diào)和肝脾，緩急止痛，治療脾虛肝旺脘腹攣急作痛或因陰血不足筋脈失養(yǎng)之四肢攣急而致痛。近年來(lái)，芍藥甘草湯的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，藥理研究也更加深入。有文獻(xiàn)報(bào)道稱芍藥甘草湯具有養(yǎng)血護(hù)肝，解毒止痛，降低轉(zhuǎn)氨酶，消除黃疸等功效［2］。嘗試構(gòu)建“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，旨在系統(tǒng)完整地找出芍藥甘草湯發(fā)揮保肝作用的藥效關(guān)鍵成分和藥效部位，為更加深入地闡釋白芍?甘草藥對(duì)抗肝損傷的活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供參考，為藥理研究和臨床應(yīng)用提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 中藥潛在化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)的整理與篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP：http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）［3］中篩選白芍、甘草的化學(xué)成分，其中包括口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug?likeness，DL）。將OB≥30%，DL≥0.18 為條件篩選出潛在化學(xué)成分。檢索日期為2019 年9 月。

1.2 預(yù)測(cè)并構(gòu)建成分靶點(diǎn)集 在PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）［4］中搜集潛在活性成分的SMILE 結(jié)構(gòu)式。通 過(guò)SwissTargetPrediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）［5］數(shù)據(jù)庫(kù)和TargetNET（http：／ ／targetnet.scbdd.com）［6］數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)成分靶點(diǎn)。SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)以可能性（probability）TOP30為納入標(biāo)準(zhǔn)。TargetNET 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選符合里賓斯基五規(guī)則（Lipinski’ s Rule of Five）≥50%的成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，將得到的靶點(diǎn)以pro ＝1 為原則納入數(shù)據(jù)，且均選擇人類數(shù)據(jù)庫(kù)（Homo sapiens）。檢索日期為2019 年9 月。

1.3 預(yù)測(cè)并構(gòu)建成分靶點(diǎn)集 通過(guò)DisGeNET（http：／ ／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／home）［7］數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索“Liver injury”“Liver disease”“hepatic injury”等關(guān)鍵詞，篩選出疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建疾病靶點(diǎn)集。在Uniprot（http：／ ／www.uniprot.org／）［8］數(shù)據(jù)庫(kù) 中獲得 靶點(diǎn)的Uniprot ID，將成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并將兩者取交集，得到中藥治療疾病的潛在靶點(diǎn)集。檢索日期為2019 年9 月。

1.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 通過(guò)生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID，https：／ ／david.ncifcrf.gov／）［9］的Functional Annotation 功能對(duì)潛在靶點(diǎn)集進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析及KEGG 通路富集分析。GO 富集分析由生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3 個(gè)部分組成，三者均設(shè)置P＜0.05，且均選擇人類數(shù)據(jù)庫(kù)（Homo sapiens）。檢索日期為2019 年9 月。

1.5 構(gòu)建“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 將整理的中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1 軟件中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 應(yīng)用ROC 曲線評(píng)價(jià)白芍?甘草藥對(duì)的共同靶點(diǎn) 利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，找到與非酒精性脂肪肝相關(guān)（Non?alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的數(shù)據(jù)集，使用R 語(yǔ)言的limma 包作差異分析，圍繞8 個(gè)相同靶點(diǎn)構(gòu)建受試者工作特征曲 線（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC 曲線），以血藥濃度?時(shí)間曲 線下面積（Area Under Concentration?time Curve，AUC）評(píng)價(jià)藥對(duì)白芍?甘草藥對(duì)中對(duì)NAFLD 的治療效應(yīng)和診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 白芍?甘草藥對(duì)潛在活性成分與潛在靶點(diǎn)的篩選結(jié)果以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為條件，篩選出白芍活性成分10 個(gè)（刪除3 個(gè)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)SMILE 格式的成分），甘草活性成分73 個(gè)，見(jiàn)表1～2。通過(guò)SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)和TargetNET 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)并構(gòu)建成分靶點(diǎn)集，得到白芍潛在活性成分靶點(diǎn)168 個(gè)，甘草潛在活性成分靶點(diǎn)515 個(gè)。

表1 白芍潛在活性成分

表2 甘草潛在活性成分

續(xù)表2

2.2 白芍?甘草藥對(duì)抗肝損傷靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出疾病相關(guān)靶點(diǎn)共605 個(gè)（刪除重復(fù)靶點(diǎn)）。將芍藥、甘草預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別與疾病靶點(diǎn)取交集，篩除重復(fù)信息，得到芍藥?甘草藥對(duì)與肝損傷疾病相關(guān)的靶點(diǎn)共77 個(gè)，其中白芍34 個(gè)，甘草72 個(gè)。

2.3 GO 富集分析與KEGG 通路富集分析 GO 富集分析結(jié)果顯示，BP 分析結(jié)果222 個(gè)，包括凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)、藥物反應(yīng)、積極調(diào)控細(xì)胞增殖等作用途徑；CC分析結(jié)果21 個(gè)，主要是包含膜筏、磷脂酰肌醇3?激酶復(fù)合物、細(xì)胞器膜、質(zhì)膜、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、胞液等；MF 分析結(jié)果66 個(gè)，包括配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、磷脂酰肌醇3?激酶活性、1?磷脂酰肌醇?4?磷酸3?激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷脂酰肌醇?4，5?雙磷酸3?激酶活性、藥物結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子途徑。

KEGG 通路富集分析得到85 條結(jié)果，篩選得到41 條通路與抗肝損傷有關(guān)，包括腎素?血管緊張素系統(tǒng)（ReninAngiotensin System，RAS）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子?1（hypoxia?inducible factor?1，HIF?1）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生子因子（Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF）信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、RAS 相關(guān)蛋白1（RAS?related protein 1，RAP1）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡、Fc epsilon RI 信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、乙肝和NAFLD 等。

將GO 富集分析與KEGG 富集分析結(jié)果按P 值升序排列，使用R 語(yǔ)言將結(jié)果TOP15 分別繪制成氣泡圖，其中氣泡越大表示涉及靶點(diǎn)越多，顏色由藍(lán)漸變至紅表示與研究目的呈顯著性升高態(tài)勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 BP、CC、MF 及KEGG 富集分析結(jié)果（前15）

2.4 繪制“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 將KEGG通路分析的結(jié)果整理出來(lái)，導(dǎo)入Cytoscape3.2.1 軟件繪制“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），包括中藥2個(gè)，成分77 個(gè)，靶點(diǎn)48 個(gè)，通路41 條，疾病1 個(gè)。根據(jù)自由度（Degree）由高到低篩選核心中藥成分，包括（E）?1?（2，4?dihydroxyphenyl）?3?（2，2?dimethylchromen?6?yl）prop?2?en?1?one、Licoagroisoflavone（甘草異黃 酮）、glypallichalcone（刺甘草 查耳酮）、1?methoxyphaseollidin（1?甲氧基 菜豆素）、shinpterocarpin、licochalcone B（甘草查耳酮 B）、8?（6?hydroxy?2?benzofuranyl）?2，2?dimethyl?5?chromenol、glabrone（光果甘草酮）、licoisoflavanone（甘草異黃烷酮）、licoisoflavone B（甘草異黃酮B）、kaempferol（山柰酚）、（3S，5R，8R，9R，10S，14S）?3，17?dihydroxy?4，4，8，10，14?pentamethyl?2，3，5，6，7，9?hexahydro?1H?cyclopenta ［a］phenanthrene?15，16?dione、jaranol（梔子醇）、quercetin（槲皮素）、odoratin（芳香膜菊素）、licoagrocarpin、gadelaidic acid（反9?甘碳烯酸）、icos?5?enoic acid、quercetin der.、isoglycyrol（異甘草酚）、eurycarpin A（黃甘草異黃酮A）、（E）?3? ［3，4?dihydroxy?5?（3?methylbut?2?enyl）phenyl］ ?1?（2，4?dihydroxyphenyl）prop?2?en?1?one、2?（3，4?dihydroxyphenyl）?5，7?dihydroxy?6?（3?methylbut?2?enyl）chromone、Gancaonin B（甘草寧B）、isotrifoliol、glyasperin F（粗毛甘草素F）、（2S）?2? ［4?hydroxy?3?（3?methylbut?2?enyl）phenyl］ ?8，8?dimethyl?2，3?dihydropyrano［2，3?f］ chromen?4?one、lupiwighteone（黃羽扇豆魏特酮）、medicarpin（美迪紫檀素）、calycosin（毛異黃 酮）、xambioona、glyzaglabrin（光甘草輪）、licoisoflavone（甘草異黃酮）、5，7?dihydroxy?3?（4?methoxyphenyl）?8?（3?methylbut?2?enyl）chromone、3?（3，4?dihydroxyphenyl）?5，7?dihydroxy?8?（3?methylbut?2?enyl）chromone、gancaonin A（甘草寧A）、licochalcone G（甘草查耳酮G）、glepidotin A（鱗葉甘草素A）、semilicoisoflavone B、sitosterol（谷甾醇）、isorhamnetin（異鼠李素）、β?sitosterol（β?谷甾醇）、phaseol、gancaonin H（甘草寧H）、gancaonin G（甘草寧G）、7?acetoxy?2?methylisoflavone（7?乙酰氧 基?2?甲基異 黃酮）、HMO、isolicoflavonol（異甘草黃酮醇）、licoricone（甘草利酮）、7?methoxy?2?methyl isoflavone、glycyrol（甘草酚）、inermine、licochalcone a（甘草查耳酮 A）、formononetin（刺芒柄花素）、paeoniflorin（芍藥苷）等。

圖2 白芍?甘草藥對(duì)抗肝損傷的“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖48 個(gè)靶點(diǎn)中，包括白芍15 個(gè)，甘草41 個(gè)，其中有8 個(gè)相同靶點(diǎn)，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 以及基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2。為了更清晰地分析白芍?甘草藥對(duì)的協(xié)同作用，將圍繞以上8個(gè)相同靶點(diǎn)再次構(gòu)建“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。增強(qiáng)對(duì)芍藥甘草湯保肝作用的微觀整體認(rèn)識(shí)。所構(gòu)建的8 個(gè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析圖顯示，靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括類固醇激素合成和藥物代謝?細(xì)胞色素P450（drug metabolism cytochrome p450），PPARG 的作用 通路包 括PPAR 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化和AMPK 信號(hào)通路，PIM1的作用通路是Jak?STAT 信號(hào)通路，PTGS2 的作用通路是脂解脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)，SYK 的作用通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、NF?κB 信號(hào)通路、血小板活化、破骨細(xì)胞分化、PI3K?Akt 信號(hào)通路、FcγR 介導(dǎo)的吞噬作用、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、FcepsilonRI 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、VEGF 信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路，MMP1 的作用通路包括PPAR 信號(hào)通路，MMP2 的作用通路包括白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移，MMP9 的作用通路包括TNF 信號(hào)通路、乙型肝炎和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。

圖3 “中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 ROC 曲線評(píng)價(jià)結(jié)果 在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到符合條件的GSE37031 數(shù)據(jù)集［10］，將白芍、甘草的相同靶點(diǎn)輸入驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，并繪制ROC 曲線（圖4）。AUC 分?jǐn)?shù)在0.50～1 之間具有預(yù)測(cè)價(jià)值，0.70 以上說(shuō)明診斷價(jià)值良好，0.90 以上說(shuō)明診斷價(jià)值較高。如圖所示，CYP1A2、PIM1、PTGS2、MMP9 的AUC 分?jǐn)?shù)均處于0.70 以上，其中CYP1A2 和PTGS2 的AUC 分?jǐn)?shù)超過(guò)0.9，表示在NAFLD 進(jìn)程中，其診斷價(jià)值較高，且與健康對(duì)照組比較，疾病組的CYP1A2 和PTGS2 的表達(dá)具有顯著差異（P＜0.05），其他相同靶點(diǎn)的表達(dá)不顯著。

圖4 ROC 曲線圖

3 討論

關(guān)于芍藥甘草湯的藥理研究及臨床應(yīng)用多集中于消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和腫瘤癌癥等疾病，近些年研究顯示其還具有保肝作用。目前，該方針對(duì)保肝作用的藥理實(shí)驗(yàn)僅為研究其有效組群芍甘多苷（含芍藥總苷、甘草酸和總黃酮苷）的保護(hù)急性肝損傷作用［11］，或白芍和甘草單味藥的有效成分保肝機(jī)理研究較多，但是關(guān)于芍藥甘草湯整體保肝作用機(jī)制尚未有系統(tǒng)完整地挖掘分析，同時(shí)對(duì)白芍?甘草藥對(duì)的其他化學(xué)成分和作用機(jī)制也鮮有報(bào)道。但因白芍?甘草藥對(duì)配伍后其活性成分含量存在改變，且部分活性成分使用效用顯著增強(qiáng)，如甘草可以促進(jìn)芍藥中芍藥苷的吸收，芍藥可提前助燃甘草中甘草次酸在體內(nèi)出現(xiàn)的時(shí)間和數(shù)量［12?14］，所以本項(xiàng)研究通過(guò)篩選白芍?甘草藥對(duì)中治療肝損傷的活性成分，獲取靶點(diǎn)，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，利用GO 及KEGG 分析其生物過(guò)程及信號(hào)通路，系統(tǒng)闡釋了其具有保肝作用的活性成分和作用機(jī)制。

3.1 白芍?甘草藥對(duì)存在多種潛在成分對(duì)肝損傷有抑制作用 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，白芍?甘草藥對(duì)治療肝損傷的活性成分中主要包括甘草黃酮類化合物如甘草查耳酮A、毛異黃酮，以及山奈酚、槲皮素、異鼠李素、芍藥苷、β?谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等。最后篩選整理得到的成分中包括了大部分已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有保肝作用有效成分，表明了研究數(shù)據(jù)的合理性。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，白芍總苷有抗炎、鎮(zhèn)痛，保肝等藥理作用［15?16］。其中芍藥苷對(duì)不同種類型肝損傷均有保護(hù)作用，例如通過(guò)NAFLD 及其多種信號(hào)途徑來(lái)抑制肝膽固醇的脂質(zhì)合成，可以保護(hù)肝臟抗氧化、抗炎、抗凋亡［17?20］。甘草黃酮類化合物、甘草酸及其衍生物對(duì)多種肝損傷有保護(hù)作用［21?26］。

與此同時(shí)，還存在多種潛在成分跟上述成分共同構(gòu)成了白芍－甘草藥對(duì)的抗肝損傷作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如山奈酚可減輕肝纖維化，具有抗氧化和保肝活性［25，27］。槲皮素是一種生物類黃酮，通過(guò)調(diào)控PI3K／Akt／NF?κB 信號(hào)通路來(lái)改善NAFLD 的肝組織脂肪變性程度，減輕肝臟炎癥［28?29］。植物甾醇可抑制肝臟內(nèi)膽固醇的生物合成和阻斷致癌物誘發(fā)癌細(xì)胞形成等功能，有研究顯示，β?谷甾醇能夠提高免疫功能且具有一定抗腫瘤作用，可緩解DMN 誘導(dǎo)的肝臟損傷，防止膠原蛋白的積聚［30?31］。異鼠李素可抑制肝星狀細(xì)胞活化，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和自噬，具有抑制肝纖維化的作用［32］。刺芒柄花素通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減少肝損傷并恢復(fù)肝細(xì)胞谷胱甘肽起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用［33］。

3.2 白芍?甘草藥對(duì)中重要潛在靶蛋白通過(guò)炎癥通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和其他相關(guān)通路對(duì)肝損傷有保護(hù)作用 根據(jù)篩選得到芍藥甘草湯與肝損傷相關(guān)的活性靶點(diǎn)有48 個(gè)，其中包括白芍?甘草藥對(duì)的相同靶點(diǎn)8 個(gè)，即CYP1A2、PIM1、PPARG、PTGS2、SYK 和基質(zhì) 金屬蛋 白酶家 族MMP9、MMP1、MMP2。圍繞其相同靶點(diǎn)構(gòu)建的“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）含88 個(gè)點(diǎn)，204 條邊，表示這8 個(gè)靶點(diǎn)可視為白芍?甘草藥對(duì)作為發(fā)揮藥效的重要潛在靶點(diǎn)。以NAFLD 為例，ROC 曲線評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 具有顯著意義。靶蛋白CYP1A2 的作用通路包括類固醇激素合成和藥物代謝?細(xì)胞色素P450，藥物代謝?細(xì)胞色素P450 中存在負(fù)責(zé)代謝異生物的酶，有研究表明，CYP 基因參與肝臟的異種生物和藥物代謝，且其中的CYP1A2 可以在肝細(xì)胞中參與多種外來(lái)化合物及藥物代謝［34?36］。PTGS2 具有抗氧化和抗炎作用，有助于改善肝損傷［37］，提示白芍?甘草藥對(duì)配伍可能發(fā)揮協(xié)同作用，一方面調(diào)節(jié)CYP1A2 的轉(zhuǎn)錄，改變其活性，促進(jìn)藥物代謝，另一方面通過(guò)靶蛋白PTGS2 調(diào)節(jié)脂解脂肪細(xì)胞，在NAFLD 進(jìn)程中有保護(hù)肝臟的作用。另外，靶蛋白SYK 的作用通路包括PI3K?Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝和TNF 信號(hào)通路等。PI3K?Akt 信號(hào)通路是參與細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、凋亡和增殖的重要節(jié)點(diǎn)，能被多種類型的細(xì)胞刺激或毒性刺激所激活，蛋白一旦激活，Akt 即可通過(guò)磷酸化介導(dǎo)生長(zhǎng)因子促增殖、抗凋亡發(fā)揮抗肝損傷作用［38?41］；VEGF又稱血管滲透因子，其表達(dá)與肝纖維化和肝內(nèi)血管增生有關(guān)［42?43］；花生四烯酸代謝物作為脂類介質(zhì)在調(diào)節(jié)肝臟的生理和病理過(guò)程中起著重要作用，與其他致炎因子如自由基、TNF、IL?1 等共同介導(dǎo)肝損傷，通過(guò)干擾花生四烯酸可能對(duì)肝損有重要作用［44?48］。在基質(zhì)金屬蛋白酶家族有關(guān)的通路中，肝臟選擇性MMP?9 抑制可防止肝臟VEGF 的蛋白分解，具有改善損傷，加速肝臟的再生的作用［49］，MMP9 的作用通路還包括白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路，該通路與肝臟血管內(nèi)發(fā)生缺血?再灌注損傷關(guān)系密切［50］。

結(jié)合“中藥?成分?靶點(diǎn)?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）與KEGG 的分析結(jié)果顯示，白芍?甘草藥對(duì)的其他信號(hào)通路可能也是其發(fā)揮保肝作用的重要途徑。包括Ras 信號(hào)通路、HIF?1 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡和NAFLD 等。RAS 的失衡與肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)Ras 信號(hào)通路的相關(guān)信號(hào)分子，可以抑制肝星狀細(xì)胞活化和抗肝纖維化，通過(guò)阻斷肝臟中RAS 對(duì)改善血脂狀況和限制NAFLD 的進(jìn)展具有潛在意義，可以改善胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用［51?53］；缺氧是誘導(dǎo)肝臟局部炎癥和血管生成的主要因子，可引起的相關(guān)炎癥反應(yīng)和纖維化，HIF?1 與VEGF 的表達(dá)在抗氧化和促進(jìn)血管新生中發(fā)揮重要作用［54］；RAP1 是人肝細(xì)胞癌的一個(gè)重要的原癌基因，與細(xì)胞增殖、克隆形成和侵襲有關(guān)，肝細(xì)胞中眼缺失蛋白同源物4（eyes absent homolog 4，EYA4）通過(guò)抑制RAP1 反式激活可實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，另外，通過(guò)抑制Rap1b 在肝細(xì)胞中的表達(dá)，可抑制氧化應(yīng)激后肝細(xì)胞ERK 通路激活，熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）的細(xì)胞保護(hù)作用以及肝細(xì)胞的抗氧化能力［55］。綜上所述，白芍?甘草藥對(duì)保肝作用與多條通路相關(guān)，如炎癥通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和其他相關(guān)通路，且這些通路是目前研究抗肝損傷的重要通路。

4 結(jié)論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)芍藥甘草湯具有保肝作用的潛在活性成分、靶點(diǎn)、作用通路及其機(jī)制有了更深一步的認(rèn)識(shí)。研究結(jié)果顯示，白芍?甘草藥對(duì)發(fā)揮藥效主要通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎性因子，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，或者通過(guò)多種代謝途徑，降低肝臟內(nèi)的脂質(zhì)水平，或者通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和活化，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。藥對(duì)的主要活性成分包括甘草黃酮類化合物如甘草查耳酮A、毛異黃酮，以及山奈酚、槲皮素、異鼠李素、芍藥苷、β?谷甾醇、刺芒柄花素和甘草酸及其衍生物等，可能依靠CYP1A2、PTGS2、SYK 和基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP9、MMP1、MMP2 等靶蛋白，單獨(dú)、相互或共同干預(yù)Ras 信號(hào)通路、HIF?1 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、Pl3k?akt 信號(hào)通路、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡和NAFLD 等。另外，根據(jù)ROC 分析結(jié)果顯示，白芍?甘草藥對(duì)共同靶蛋白CYP1A2 和PTGS2 對(duì)NAFLD 具有較好的治療效應(yīng)和診斷價(jià)值，其作用途徑與類固醇激素合成、藥物代謝?細(xì)胞色素P450 和脂解脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)和多途徑的作用特點(diǎn)，日前尚未能對(duì)芍藥甘草湯抗肝損傷的主要靶點(diǎn)和通路及作用機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。