樊燕青，孫蘭池，李大鵬

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明650500； 2.大同市第三人民醫(yī)院口腔科，山西 大同 037000）

舌鱗狀細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占口腔惡性腫瘤的40%［1］。舌鱗狀細(xì)胞癌惡性程度高，浸潤(rùn)性強(qiáng)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前，舌鱗狀細(xì)胞癌的治療主要采取以手術(shù)為主的綜合治療，但患者預(yù)后較差，5 年生存率低［2］，因此，尋找用于治療舌鱗狀細(xì)胞癌的新藥具有積極意義。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中藥茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效［3］。近年來(lái)，茯苓酸的抗腫瘤作用備受關(guān)注。研究顯示，茯苓酸可抑制腎癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤中細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4?6］。然而，茯苓酸在舌鱗狀細(xì)胞癌的作用及其調(diào)控機(jī)制還未知。本研究以舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞為研究對(duì)象，主要探討了茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響及。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 茯苓酸，貨號(hào)MR80187，純度≥98%，20 mg／支，上海銘睿生物科技有限公司（準(zhǔn)確稱取0.529 mg茯苓酸于10 mL 量瓶中，加入10 μL 二甲基亞砜，茯苓酸溶解后超純水定容至10 mL，配制為100 μmol／L 母液，使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋為所需濃度）。DMSO，國(guó)藥編號(hào)30072418，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（取10 μL DMSO用超純水定容至10 mL，配制1%DMSO 溶液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋10 倍）。舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞CAL?27，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（FBS，批號(hào)20190510）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)20190311）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）?異硫氰酸熒光素（FITC）／碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)20190421）、細(xì)胞周期試劑盒（批號(hào)201900324）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190329），北京索萊寶生物科技有限公司；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）和胰蛋白酶，美國(guó)Sigma 公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國(guó)Invitrogen 公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶Ⅱ（CDK2，批號(hào)20190225）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1，批號(hào)20181229）、活化的半胱天冬酶?3（Cleaved caspase?3，批號(hào)20181225）和CXC 趨化因子受體4（CXCR4，批號(hào)20190123）多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；活化的多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved PARP）抗體，批號(hào)20190126，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAL?27 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇CAL?27 細(xì)胞，用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)CAL?27 細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期CAL?27 細(xì)胞接種至6 孔板中（1.0×105／孔），培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別轉(zhuǎn)染CXCR4 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA?CXCR4）及空載體（pcDNA）至CAL?27 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h 后，棄培養(yǎng)液，重新加含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 CAL?27 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細(xì)胞均接種于96 孔板中（1.0×104個(gè)），培養(yǎng)12 h 后分組處理。CAL?27 細(xì)胞分為空白組、0.1% DMSO 組、茯苓酸2 μmol／L 組、茯苓酸4 μmol／L 組和茯苓酸8 μmol／L 組，其中空白組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基干預(yù)48 h，0.1% DMSO 組細(xì)胞用含0.1% DMSO 的培養(yǎng)基干預(yù)48 h，茯苓酸2 μmol／L 組、茯苓酸4 μmol／L 組、茯苓酸8 μmol／L組細(xì)胞分別用含2、4、8 μmol／L［7］茯苓酸的培養(yǎng)基干預(yù)48 h。轉(zhuǎn)染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細(xì)胞均用含8 μmol／L 茯苓酸的培養(yǎng)基干預(yù)48 h，并分別記為茯苓酸＋pcDNA?CXCR4 組、茯苓酸＋pcDNA 組。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加20 μL MTT（5 mg／mL）。孵育4 h 后，棄培養(yǎng)基，加150 μL DMSO，混合均勻，于酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)OD。細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組／OD對(duì)照組）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 CAL?27 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細(xì)胞接種于24 孔板中（2.5×104個(gè)），培養(yǎng)12 h 后，按照“1.2.2”分組處理。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次后，加500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加10 μL Annexin V?FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μL PI，室溫避光孵育5 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 CAL?27 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細(xì)胞接種于24 孔板中（2.5×104個(gè)），培養(yǎng)12 h 后按“1.2.2”項(xiàng)下方法分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞。用PBS 液清洗2 次后，加70% 乙醇4 ℃固定24 h，離心（2 000 r／min、5 min），棄上清，加PBS 重懸細(xì)胞，離心（2 000 r／min、5 min），棄上清，加100 μL RNase A 重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min 后，加400 μL PI，4 ℃避光孵30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè) 細(xì)胞中 CyclinD1、CDK2、Cleaved PARP、Cleaved caspase?3 和CXCR4 蛋白表 達(dá)CAL?27 細(xì)胞或轉(zhuǎn)染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細(xì)胞接種于24 孔板中（2.5×104個(gè)），培養(yǎng)12 h 后按“1.2.2”項(xiàng)下方法分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞。用RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA 法定量、行十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別用CyclinD1（1 ∶ 500）、CDK2（1 ∶ 500）、Cleaved PARP（1 ∶1 000）、Cleaved caspase?3（1 ∶1 000）、CXCR4（1 ∶1 000）和β?actin（1 ∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，再用加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗IgG（1 ∶2 000）37 ℃孵育1 h。滴加顯影液，避光顯影后，曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對(duì)于β?actin 的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞增殖的影響 由表1 可見(jiàn)，與空白組比較，0.1% DMSO 組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞存活率無(wú)變化（P＞0.05）；與0.1%DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。

表1 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

表1 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

注：與0.1% DMSO 組比較，*P＜0.05。

2.2 不同濃度的茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞凋亡的影響 由圖1、表2 可見(jiàn)，與空白組比較，0.1% DMSO組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)無(wú)變化（P＞0.05）；與0.1%DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

表2 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖1 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞凋亡和Cleaved caspase?3、Cleaved PARP 蛋白表達(dá)的影響

2.3 不同濃度的茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞周期的影響 由圖2、圖3、表3 可見(jiàn)，與空白組比較，0.1%DMSO 組CAL?27 細(xì)胞G0?G1 期、S 期、G2?M 期細(xì)胞數(shù)及CyclinD1 和CDK2 蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與0.1% DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組G0?G1 期細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05），S 期和G2?M 期細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

表3 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞周期的影響（， n＝9）

表3 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞周期的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖2 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞周期的檢測(cè)

2.4 不同濃度的茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞CXCR4 表達(dá)的影響 由圖4、表4 可見(jiàn)，與空白組比較，0.1% DMSO 組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)無(wú)變化（P＞0.05）。與0.1% DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細(xì)胞CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

表4 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞CXCR4 表達(dá)的影響（， n＝9）

表4 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞CXCR4 表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖4 不同濃度的茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)CXCR4 降低茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響 由圖5、圖6、表5 可見(jiàn)，與茯苓酸＋pcDNA 組比較，茯苓酸＋pcDNA?CXCR4 組CAL?27 細(xì)胞CXCR4 蛋白表達(dá)和細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），G0?G1 期細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05），S 期和G2?M 期細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 的蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

表5 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響（， n＝9）

表5 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響（， n＝9）

注：與0.1% DMSO 組比較，*P＜0.05；與茯苓酸＋pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

圖5 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)的影響

圖6 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞周期的影響

2.6 過(guò)表達(dá)CXCR4 降低茯苓酸促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27細(xì)胞凋亡 由圖7、表6 可見(jiàn)，與茯苓酸＋pcDNA 組比較，茯苓酸＋pcDNA? CXCR4 組舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖7 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞凋亡及Cleaved caspase?3 和Cleaved PARP 蛋白表達(dá)的影響

表6 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝9）

表6 茯苓酸對(duì)過(guò)表達(dá)CXCR4 的CAL?27 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝9）

注：與0.1%＋DMSO 組比較，*P＜0.05；與茯苓酸＋pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌具有較高的發(fā)病率，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移［8］。目前，舌鱗狀細(xì)胞癌以手術(shù)治療為主，但多數(shù)患者術(shù)后存在面容改變及部分顏面功能喪失的情況，生活質(zhì)量受到影響。舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因的復(fù)雜過(guò)程。細(xì)胞的異常增殖和凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，尋找抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物對(duì)于治療舌鱗狀細(xì)胞癌及改善患者預(yù)后均具有重要意義。

茯苓酸是茯苓的主要活性成分，其抗腫瘤作用受到廣泛作用。研究顯示，茯苓酸可抑制胃癌SGC?7901 細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)SGC?7901 細(xì)胞的G0－ G1細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，具有一定的抗胃癌作用［9］。本研究顯示，茯苓酸作用舌鱗狀細(xì)胞癌CAL?27 細(xì)胞后，CAL?27 細(xì)胞存活率降低，G0?G1期細(xì)胞數(shù)增加，而S 期和G2?M 期細(xì)胞數(shù)降低，這說(shuō)明茯苓酸可阻滯CAL?27 細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。此外，茯苓酸作用CAL?27 細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，說(shuō)明茯苓酸可誘導(dǎo)CAL?27 細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果說(shuō)明茯苓酸也發(fā)揮抗舌鱗狀細(xì)胞癌的作用，是治療舌鱗狀細(xì)胞癌的潛在藥物。

細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調(diào)控［10］。CyclinD1 可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S 期轉(zhuǎn)變，縮短細(xì)胞周期，加速細(xì)胞增殖［11］。CDK2 與相應(yīng)的Cyclin 結(jié)合后被激活，使細(xì)胞通過(guò)G1／S 期檢驗(yàn)點(diǎn)并進(jìn)入S 期。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的一種途徑。PARP 是一類蛋白質(zhì)翻譯修飾酶，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［12］。PARP 被過(guò)度激活時(shí)，可引起細(xì)胞能量耗竭進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡［13］。caspase 級(jí)聯(lián)反 應(yīng)參與 細(xì)胞凋 亡，caspase?3 是caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其被活化后執(zhí)行細(xì)胞凋亡。本研究顯示，茯苓酸作用CAL?27 細(xì)胞后，細(xì)胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表 達(dá)降低，而Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明茯苓酸可通過(guò)調(diào)控CyclinD1、CDK2 及Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

CXCR4 是典型的G 蛋白偶聯(lián)受體，與子宮內(nèi)膜癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14?16］。Duan等［17］研究顯示，沉默CXCR4 表達(dá)可在體外阻礙舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且在體內(nèi)通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2／9 的蛋白表達(dá)、促進(jìn)E?鈣粘蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。孫小英等［18］研究顯示，舌鱗狀細(xì)胞癌組織中CXCR4 蛋白表達(dá)高于癌旁組織，上調(diào)CXCR4 表達(dá)可增強(qiáng)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113 的增殖、侵襲和遷移能力。為了進(jìn)一步探討茯苓酸發(fā)揮抗舌鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制，本研究首先檢測(cè)了茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，茯苓酸可降低CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 蛋白表達(dá)，而過(guò)表達(dá)CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 后，茯苓酸對(duì)CAL?27 細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響降低，提示茯苓酸通過(guò)下調(diào)CAL?27 細(xì)胞中CXCR4 表達(dá)發(fā)揮抗舌鱗狀細(xì)胞癌作用。

綜上所述，茯苓酸可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞CAL?27 增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，其作用機(jī)制與下調(diào)細(xì)胞中CXCR4 表達(dá)有關(guān)。本研究尚存在不足之處，僅在細(xì)胞層面初步探討了茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，接下來(lái)本研究將通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討茯苓酸對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制。