李亞楠，倪 娟，方禹舜，談鴻飛，周觀金，張青松*

（1.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢430030； 2.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院血液風(fēng)濕科，湖北 武漢 430030）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種多因素導(dǎo)致的退化性肌肉骨骼疾病，軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)可能介導(dǎo)其發(fā)展［1?2］。OA 的主要病理特征為軟骨細(xì)胞減少，細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，滑膜炎癥反應(yīng)以及軟骨和軟骨下骨深層形態(tài)的改變［3］。據(jù)估計(jì)，全世界10%～20%人口受到OA 的影響，其發(fā)病率可能隨著壽命延長(zhǎng)而增長(zhǎng)［4］。OA 的病因尚未確定，軟骨細(xì)胞的異常凋亡可導(dǎo)致軟骨損傷從而引起OA［5］。目前，OA 的治療大多只針對(duì)臨床癥狀而非病因，僅僅緩解了疼痛，不能防治軟骨損傷和其他關(guān)節(jié)組織的破壞［4］。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化等藥理作用［6?7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可緩解脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡［8］，但其抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制并未進(jìn)行深入探討。本研究將從線粒體功能損傷介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度，進(jìn)一步探討姜黃素抑制軟骨細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 4 周齡清潔級(jí)SD 雌性大鼠5 只，體質(zhì)量（150±20）g，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2017?0012］，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)42010200002112）。

1.2 藥物與試劑 姜黃素（美國(guó)Sigma?Aldrich 公司，批號(hào)C1386?5G）；脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma?Aldrich 公司，批號(hào)L2630?10MG）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)SH30022.01B）；胎牛血清、II 型膠原酶（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)10270?106、17101015）；青?鏈霉素?兩性霉素B 溶液（三抗）、甲苯胺藍(lán)染色液、Hochest 33258 染色液、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤?2（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）抗體、兔抗Bcl?2 相關(guān)X 蛋白（Bcl?2 associated X protein，Bax）抗體、兔抗細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt?c）抗體、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶?3（cysteinyl aspartate specific proteinase?3，caspase?3）抗體、兔抗caspase?9 抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào) PAB180056、PAB180070、PAB180033、PAB180052、PAB180006、PAB30599、PAB30727、PAB30055、PAB30074、PAB30094）；ATP 測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)A095）；PVDF 膜、化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)IPVH00010、WBKLS0010）。

1.3 儀器 DMIL LED 倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；CytoFLEXS 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；mini protean 3 cell 電泳儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）；Tanon?5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠軟骨原代細(xì)胞的分離 將大鼠頸椎脫臼致死，于無菌條件下取其膝關(guān)節(jié)處軟骨，使用PBS 清洗3 次。將軟骨剪成大小為1 mm3碎塊，加入0.2% II 型膠原酶，置于振蕩器上振蕩1 h。加入0.25% 胰蛋白酶消化30 min 后，終止消化。收集上清液，200 目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 500 r／min 離心10 min，棄上清，使用含10% 胎牛血清，100 U／mL 青霉素和100 mg／L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，再重懸于DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2 d 更換1 次培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿瓶底80% 左右時(shí)，離心收集細(xì)胞，使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞 將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于放有載玻片的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h 后使用4% 甲醛進(jìn)行固定。加入甲苯胺藍(lán)染液，完全覆蓋細(xì)胞染色5 min，PBS 沖洗，將細(xì)胞置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 細(xì)胞模型制備與分組處理 參考文獻(xiàn)［8］。取生長(zhǎng)狀況良好的大鼠軟骨細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，以1.0×105／mL 將細(xì)胞接種于24 孔板內(nèi)，每孔加入2 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組及姜黃素低、中、高劑量組，除對(duì)照組外，其他4 組細(xì)胞均采用含有5 μg／L LPS 培養(yǎng)基刺激1 h 構(gòu)建軟骨細(xì)胞炎癥模型。姜黃素低、中、高劑量組的培養(yǎng)基中分別加入5、10、20 μmol／L 姜黃素干預(yù)24 h 后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況 收集上述分組處理后的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗2 次，Hoechst 33258 染色液覆蓋細(xì)胞，室溫染色5 min，PBS 清洗5 次，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及凋亡水平。

2.5 流式檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 收集1.0×105～5.0×105個(gè)細(xì)胞重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC?1 染色工作液，混勻，室溫孵育30 min。4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。JC?1 染色緩沖液（1×）洗滌2次，將細(xì)胞重懸于JC?1 染色緩沖液（1×）中，4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細(xì)胞沉淀，再加入1 mL JC?1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，4 ℃、1 500 r／min 離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。JC?1 染色緩沖液（1×）重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 流式檢測(cè)細(xì)胞ROS 水平 稀釋DCFH?DA，使其終濃度為10 μmol／L。將細(xì)胞懸浮于DCFH?DA 中，細(xì)胞濃度為1.0×107／mL，室溫孵育30 min，每隔5 min 混勻一下，使細(xì)胞和探針充分接觸。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 ATP 測(cè)試盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP 水平 收集各組細(xì)胞，按照ATP 測(cè)試盒說明書嚴(yán)格操作，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度。

2.8 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，以20 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS?PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（Bcl?2、caspase?3、caspase?9，1 ∶2 000；Bax、Cyt?c，1 ∶1 000），室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次，加入經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBA 洗滌3 次，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，充分接觸后，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，讀取條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，重復(fù)3 次，計(jì)量資料以（）表示。多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 軟骨細(xì)胞鑒定 甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不一，多呈梭形，胞漿著淺藍(lán)色，細(xì)胞核清晰呈圓形，著深藍(lán)色，見圖1。

圖1 甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞

3.2 姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組細(xì)胞相比，模型組出現(xiàn)部分細(xì)胞核固縮深染，凋亡小體呈亮藍(lán)色，說明模型組部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。中、高劑量的姜黃素干預(yù)后，凋亡小體減少，見圖2。

圖2 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞凋亡水平（×200）

3.3 姜黃素對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞綠色熒光增強(qiáng)（C4 區(qū)），細(xì)胞占比增多（P＜0.05），說明模型組細(xì)胞的線粒體膜電位去極化，發(fā)生早凋的細(xì)胞增多；姜黃素低、中、高劑量組線粒體去極化細(xì)胞少于模型組（P＜0.05），且中、高劑量組效果更明顯（P＜0.05），見圖3。

圖3 流式檢測(cè)軟骨細(xì)胞線粒體膜電位變化

3.4 姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞ATP 濃度的影響 對(duì)照組ATP 濃度為（364.74±24.41）μmol／g prot，模型組［（148.77±20.37）μmol／g prot］ 降低（P＜0.05）；姜黃素低劑量組ATP 濃度為（214.64±18.09）μmol／g prot，中劑量組為（243.26± 13.37）μmol／g prot，高劑量組為（297.74 ±16.83）μmol／g prot，均高于模型組（P＜0.05），高劑量組ATP 濃度高于低劑量組（P＜0.05）。

3.5 姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞ROS 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組ROS 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，姜黃素低、中、高劑量組ROS 水平降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組ROS 水平降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式檢測(cè)軟骨細(xì)胞ROS 水平變化

3.6 姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl?2 蛋白表達(dá)減低（P＜0.05）；與模型組相 比，姜黃素 低、中、高劑量 組 Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達(dá)降低，Bcl?2 蛋白表達(dá)升高，以中、高劑量組更明顯（P＜0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性。見圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)軟骨細(xì)胞Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 和Bcl?2 蛋白表達(dá)

4 討論

軟骨細(xì)胞作為軟骨中存在的唯一細(xì)胞類型，分散于細(xì)胞外基質(zhì)中，發(fā)揮著維持軟骨結(jié)構(gòu)完整性和負(fù)重功能等作用［9］。與健康軟骨相比，OA 中軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生率更高，可能是關(guān)節(jié)持續(xù)機(jī)械損傷的結(jié)果，且軟骨細(xì)胞的凋亡水平與軟骨損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［10］。軟骨細(xì)胞凋亡在OA 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，由于目前對(duì)OA 的治療僅對(duì)癥狀起作用，不能預(yù)防和治愈OA，因此，抑制軟骨細(xì)胞凋亡可能是調(diào)節(jié)OA 軟骨變性的有效靶點(diǎn)［11?12］。

細(xì)胞凋亡由復(fù)雜的信號(hào)途徑有序地觸發(fā)而引起，其中死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體控制的內(nèi)源性途徑為調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑，且這兩種途徑間相互關(guān)聯(lián)［13］。Yang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙及其級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)了OA 軟骨細(xì)胞的凋亡。在OA 的發(fā)展過程中，炎癥細(xì)胞因子進(jìn)入軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，通透性增加釋放Cyt?c，招募caspase?9 形成復(fù)合凋亡體，再激活下游凋亡效應(yīng)器caspase?3，產(chǎn)生一系列的酶聯(lián)激活反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡［15?16］。Bcl?2 家族可調(diào)控線粒體膜通透性，其中促凋亡蛋白Bax 接收到凋亡信號(hào)后向線粒體轉(zhuǎn)移，促進(jìn)Cyt?c 釋放，而抗凋亡蛋白Bcl?2 存在于線粒體外膜，抑制Cyt?c 的釋放［17］。當(dāng)線粒體功能發(fā)生故障時(shí)，可引起一系列的代謝變化，增加ROS 的產(chǎn)生，減少ATP 和氧氣的消耗［18］。Shi等［19］研究也發(fā)現(xiàn)受損的軟骨細(xì)胞釋放出ROS 并激活炎癥因子，進(jìn)而加重軟骨細(xì)胞的凋亡。

姜黃素是中藥材姜黃中主要活性成分，具有抗炎癥、抗氧化、抗分解代謝等藥理活性，在OA 中具有保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用［20］。前期研究［8］以及郭楊等［21］研究結(jié)果均證實(shí)姜黃素具有抑制OA 軟骨細(xì)胞凋亡的作用，但其具體作用機(jī)制仍需明確。袁偉等［22］認(rèn)為姜黃素可能通過抑制線粒體凋亡途徑，從而減少硝普鈉誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡。本次研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞線粒體凋亡途徑的作用，姜黃素明顯升高了炎癥軟骨細(xì)胞的線粒體膜電位以及ATP 濃度，降低ROS 水平，并抑制Bax、Cyt?c、caspase?3、caspase?9 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl?2 蛋白表達(dá)，且表現(xiàn)出姜黃素的劑量依賴性。

綜上所述，姜黃素可通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥軟骨細(xì)胞的凋亡，并改善線粒體功能故障。