陳勇德，俞維英，沈志華

（紹興市中心醫(yī)院醫(yī)共體總院，浙江 紹興 312030）

隨著生活水平的提高，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）相關(guān)疾病已躍居于人口死亡的主要原因之列。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，一般認(rèn)為其發(fā)生的機(jī)制包括自由基損傷、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂等。這些機(jī)制不是獨(dú)立發(fā)揮作用的，而是相互影響，最終導(dǎo)致斑塊的破裂，造成嚴(yán)重心腦血管疾病。這些機(jī)制中炎癥機(jī)制是研究者普遍認(rèn)可的動脈硬化機(jī)制，炎癥是機(jī)體對損傷產(chǎn)生的一種保護(hù)性反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)也可直接導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷和凋亡［1］，抗炎治療目前已經(jīng)成為動脈粥樣硬化的主要治療手段［2］。

參麥注射液是紅參、麥冬的提取物，益氣固脫，養(yǎng)陰生津，生脈。用于治療氣陰兩虛型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒細(xì)胞減少癥［3?4］。有研究表明參麥注射液能調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)［5?6］，對機(jī)體細(xì)胞起保護(hù)作用，同時降低細(xì)胞黏附因子的表達(dá)［7?9］，從而影響單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附、遷移［10］，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生本研究從參麥注射液參麥注射液對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及黏附因子的表達(dá)來探討其抗動脈粥樣硬化的機(jī)制［11］。

1 材料

1.1 試劑與藥物 參麥注射液，批號1712137，購自正大青春寶藥業(yè)有限公司，使用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至2%、5%；Human Endothelial?SFM（Thermo，批號41966052）；Medium 199（Thermo，批號 43955451）；胎牛血清（GIBCO，N170810PA）；二甲基亞砜（Sigma，RNBJ1732）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，089K0733）；磷烯醇丙酮酸（Aladdin，批號180752）；RIPA 細(xì)胞裂解液（南京建成生物工程研究所，批號170511）；BCA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號180107）；PVDF 膜（Millipore，批號R9AA8534）；ICAM?1 單抗（CST，批號875147）；VCAM?1 單抗（CST，批號457814）；β?actin（CST，批號854275）。

1.2 細(xì)胞株 THP?1 細(xì)胞，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 儀器 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；C6 plus 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；Ti2?U 熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；EPS 300 電泳儀（上海天能科技有限公司）；Tanon 4100 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；CFX connect 熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 原代HUVECs 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取新生兒臍帶，參照Human Endothelial?SFM（GIBCO）培養(yǎng)基說明，用含雙抗的Medium 199 培養(yǎng)基灌洗臍靜脈；灌洗后一端用止血鉗夾閉，另一端灌入含0.1% Ⅰ型膠原酶的Medium 199，待靜脈充盈后，用止血鉗夾閉灌入端。于22 ℃孵育25 min；收集靜脈中的消化液，并用50 mL Medium 199 繼續(xù)灌洗靜脈，收集灌洗液并合并。置于離心機(jī)中，常溫下100×g離心5 min，棄去上清，用50 mL Medium 199 重懸并洗滌細(xì)胞；細(xì)胞經(jīng)洗滌后，用5 mL Endothelial?SFM（20 μg／mL）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。同時觀察細(xì)胞生長情況；待細(xì)胞長至單層80%融合時，傳代培養(yǎng)［12］。

2.1.2 THP?1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞系采用含10% FBS、1%PEP、1%雙抗的RPMI?1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞生長密度至85%～90%時，按1 ∶2 比例進(jìn)行傳代。

2.2 細(xì)胞黏附測試 THP?1 細(xì)胞生長至70%～80%左右時進(jìn)行慢病毒（GFP 標(biāo)記）轉(zhuǎn)染，24 h 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。HUVECs 細(xì)胞生長至80%～90%時進(jìn)行接種，細(xì)胞接種至12 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)至貼壁，細(xì)胞各組除空白組外給予1μg／mL LPS 處理24 h，移去培養(yǎng)基后給藥組分別給予不同濃度的參麥注射液（2%、5%），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入GFP 標(biāo)記的THP?1 細(xì)胞（2×105／孔），培養(yǎng)30 min后用PBS 洗去漂浮細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞［13?14］。

2.3 RT?PCR 檢測用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA。產(chǎn)物經(jīng)First?Strand Synthesis System（Takara）試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，采用SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測各組mRNA 表達(dá)，反應(yīng)體系為25 μL，各引物序列為GAPDH正向5′?CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT?3′，反向5′?GATTTTGGAGGGATCTCGCT?3′；ICAM?1 正向5′? TCTGTGT CCCCCTCAAAAGTC?3′，反向5′? GGGGTCTCTATGCCCAA CAA?3′；VCAM?1 正向5′? GCTGCTCAGATTGGAGACTCA?3′，反向5′?CGCTCAGAGGGCTGTCTATC?3′；TNF?α 正向5′?CCCGAGTGACAAGAATGTAG?3′，反向 5′?TGAGGTA CAGGCCCTCTGAT?3′；IL?6 正向 5′?AATGAGGAGACT TGCCTGGT?3′，反向5′ ?GCAGGAACTGGAT CAGGACT?3′；IL?1β 正向5′?CAGATGAAGTGC TCCTTCCA?3′，反向5′?ACCAGCATCT TCCTCAGCTT?3′。

2.4 Western blot 檢測 采用RIPA 細(xì)胞裂解液提取各組HUVECs 細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍字屑尤?／4 體積的上樣緩沖液，沸水浴處理后，上樣進(jìn)行10% SDS?PAGE 電泳（50 μg／孔）。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（PVDF）并封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜。經(jīng)熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h 洗膜后，將膜置于凝膠成像儀上成像。以目的蛋白與β?actin 條帶光密度值之比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

2.5 ELISA 檢測 取對數(shù)生長期的HUVECs 細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，加入1 μg／mL LPS 孵育24 h［15］，給予含不同體積分?jǐn)?shù)的參麥注射液（2%、5%）培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明，檢測上清中IL?1β、TNF?α、IL?6 等炎癥因子的水平。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的HUVECs 細(xì)胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入LPS，以含普通培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)空白組。LPS 作用24 h 后分別給予不同濃度的參麥注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞，1 000 r／min 離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS重懸和洗滌細(xì)胞2 次，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照AnnexinV／PI 試劑盒說明書加入細(xì)胞重懸結(jié)合液190 μL，再加入10 μL PI，避光孵育5～10 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡情況。凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參麥注射液抑制LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞凋亡 空白組的凋亡率為（4.87±1.26）%，模型組的凋亡率升高至（37.86±5.61）%，2% 參麥注射液組為（25.78±3.97）%，5% 參麥注射液組為（17.34±4.15）%，呈劑量依賴性抑制HUVECs 細(xì)胞凋亡。與模型組比較，2%、5%參麥注射液凋亡率均降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 參麥注射液對脂多糖誘導(dǎo)的HUVECS 細(xì)胞凋亡的影響（n＝3）

3.2 參麥注射液抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附及相關(guān)因子表達(dá)LPS 處理HUVECs 細(xì)胞后，細(xì)胞的黏附能力增加，與空白組相比較THP?1 細(xì)胞黏附量增加，ICAM?1、VCAM?1 蛋白和mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；給予2%、5%參麥注射液處理后，細(xì)胞的黏附能力下降，ICAM?1、VCAM?1 蛋白和mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2～3。

圖2 參麥注射液抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附（n＝3）

圖3 參麥注射液對LPS 誘導(dǎo)的VCAM?1 和ICAM?1 表達(dá)影響（n＝6）

3.3 參麥注射液抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá) LPS 處理HUVECs 細(xì)胞后，細(xì)胞IL?1β、IL?6、TNF?α 表達(dá)增加（P＜0.01）；給予2%、5% 參麥注射液處理后，IL?1β、IL?6、TNF?α 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

圖4 參麥注射液抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子（TNF?α、IL?6、IL?1β）表達(dá)（n＝6）

4 討論

炎癥是動脈粥樣硬化性疾病的基本特征，同時亦是AS的始動因子。炎癥參與了AS 的不同病理過程。在AS 發(fā)展過程中，始終有大量的炎癥因子參與其中。其中TNF?α 具有直接的促炎作用，可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和釋放，促進(jìn)炎性細(xì)胞的生成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，最終促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展。而IL?6 是由多種細(xì)胞分泌，能夠放大急性炎癥反應(yīng)，促使機(jī)體產(chǎn)生慢性炎癥，并處于中心地位。炎癥因子IL?1β 可通過上調(diào)ox?LDL 及LOX?1 表達(dá)，參與死亡蛋白介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、趨化。故調(diào)整上述炎癥因子能有效緩解細(xì)胞炎癥的發(fā)生。本研究證實(shí)LPS 誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞IL?6、IL?1β 和TNF?α 的蛋白和mRNA 表達(dá)明顯增高，當(dāng)給予參麥注射液孵育后，這三種炎癥因子顯著下調(diào)。實(shí)驗(yàn)表明參麥注射液可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞炎癥的發(fā)生和發(fā)展。炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)給予人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LPS 處理后，HUVECs 細(xì)胞凋亡率顯著增加，而給予參麥注射液后凋亡率顯著降低。說明參麥注射液能有效保護(hù)LPS 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展還與黏附因子密切相關(guān)，細(xì)胞黏附因子能介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，并參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)與活化、細(xì)胞的生長與分化等一系列重要生理和病理過程。在病變形成早期VCAM?1 能促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附、遷移，在進(jìn)展期病變，促進(jìn)已遷入病灶的單核細(xì)胞滾動、T淋巴細(xì)胞的激活，并增加其它細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用。而在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的黏附因子ICAM?1 涉及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞向內(nèi)皮的黏附及遷移。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM?1、ICAM?1 的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力增加。而給予參麥注射液后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對THP?1 細(xì)胞的黏附能力下降，同時黏附因子的mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著下降。綜上所述，參麥注射液具有抑制炎癥因子表達(dá)，降低黏附因子生成，并緩解細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用。