張晨宇，謝 甦，謝 青，胡雅清，朱蔓荊，鄭 麗

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽550004； 3.邢臺市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 邢臺 054000）

乳腺癌威脅著全球女性的健康，乳腺癌位居危害女性健康的惡性腫瘤首位，其最主要的死亡原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)［1］。根據(jù)預(yù)后因素，大約30%的淋巴結(jié)陰性和70%的淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者發(fā)生復(fù)發(fā)［2］。而患者治療后死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，約有30%～40% 乳腺癌患者發(fā)展微轉(zhuǎn)移性乳腺癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌常常不可治愈，發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，其生存期大約為2～3 年，僅僅只有5%～10%患者生存期在5 年以上［3?4］。因此了解其轉(zhuǎn)移的機制對乳腺癌的早期診斷及治療具有重要意義。本課題組在前期觀察薯蕷丸對乳腺癌小鼠免疫功能的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，薯蕷丸可一定程度改善化療后乳腺癌小鼠免疫抑制狀態(tài)，得出可能是薯蕷丸增加CD4＋T 細胞的表達，激活NK 細胞，促進抗體的形成，使免疫細胞聚集到腫瘤周圍，發(fā)揮抗腫瘤的作用；同時抑制CD8＋T 細胞的表達，減少免疫效應(yīng)細胞的凋亡，增加免疫效應(yīng)細胞的活化，加強了抗腫瘤免疫。在觀察薯蕷丸對化療后乳腺癌小鼠免疫功能的影響實驗中發(fā)現(xiàn)，薯蕷丸有效升高乳腺癌小鼠白介素?2（IL?2）、γ?干擾素（INF?γ）等細胞因子的水平，并且白介素?10（IL?10）水平明顯降低，即單核／巨噬細胞、NK細胞的活性增高，加強了乳腺癌小鼠的抗腫瘤能力。薯蕷丸可以調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，上調(diào)INF?γ，抑制腫瘤壞死因子?α（TNF?α）的表達［5?6］。目前關(guān)于薯蕷丸作用于EMT還未見報道，因此，研究薯蕷丸聯(lián)合化療藥物是否對乳腺癌EMT 具有抑制作用并探討其機制具有重要意義。

1 材料

1.1 動物 健康BALB／c 小鼠24 只，雌性，6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于河北省邢臺市臨床實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀2018?004）。

1.2 細胞株 4T1 小鼠乳腺癌細胞株（中國科學(xué)院上海細胞庫）。

1.3 藥物 薯蕷丸浸膏由薯蕷20 g、甘草18 g、生曬參5 g、當(dāng)歸10 g、阿膠6 g、桂枝6 g、干地黃10 g、神曲10 g、川芎6 g、麥門冬5 g、芍藥5 g、白術(shù)5 g、杏仁5 g、柴胡6 g、桔梗5 g、茯苓5 g、干姜3 g、白蘞3 g、防風(fēng)5 g、大豆卷6 g、大棗30 g 組成，藥材購自河北省邢臺市同仁堂藥房。根據(jù)人與動物間按體表面積折算的等效劑量換算小鼠的用量，一次取5 d 的藥量進行煎熬，具體煎藥步驟為向人工智能電煎藥砂鍋中加入300 mL 水，浸泡30 min，將煎好的藥液濃縮至1.5 g 生藥／mL，置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆??；熕幬镒⑸溆铆h(huán)磷酰胺（批號19012025）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.4 試劑 胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司（20181211）；E?cadherin（873704586681）、Vimentin（873704297104）、Akt（873704880277）、p?Akt（873704464396）等抗體購自美國CST 公司；SDS?PAGE 凝膠制備試劑盒（20180914）、BCA 蛋白測 定試劑 盒（20180908）均購自北京索萊寶科技有限公司，總RNA 小量制備試劑盒（20181124）購自美國Axygen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司（AHF1430A）。

1.5 儀器 免疫印跡實驗中的所有設(shè)備均購自美國Bio Rad 公司；RT?PCR 儀器（CFX96 Optics Module）購自美國Bio Rad 公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)4T1 乳腺癌細胞株，使用含10%胎牛血清的RPM1640 培養(yǎng)基、置37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，待細胞長至90%～95%予以傳代。

2.2 復(fù)制動物模型 將24 只BABL／c 小鼠隨機分為模型組、環(huán)磷酰胺處理組和薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組，每組8 只。取對數(shù)期的4T1 乳腺癌細胞，用PBS 緩沖液將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度約為1×106／mL，取細胞懸液0.1 mL，皮下接種于小鼠右側(cè)下腹部，約7 d 即可形成5 mm×5 mm 左右的腫塊。

2.3 給藥 成瘤后，環(huán)磷酰胺組小鼠按100 mg／kg 的劑量腹腔注射注射環(huán)磷酰胺（用生理鹽水定容至0.1 mL），1次／7 d，共21 d；薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組予在腹腔注射環(huán)磷酰胺（100 mg／kg）后，再每日予以薯蕷丸（15 mL／kg）灌胃處理；模型組則予以PBS 腹腔注射及灌胃處理。各組給藥周期為21 d。

2.4 取材 第21 天，人道處死小鼠（處死前天晚上予小鼠禁食）并將其解剖，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，取其腹部腫瘤組織并將其剝離，觀察色澤、質(zhì)地并拍照記錄，測量大小后裝入提前標(biāo)記的離心管并迅速至于液氮中，－80 ℃保存。抑瘤率＝ ［（模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重）／ 模型組平均瘤重］ ×100%。

2.5 Western blot 檢測 檢測小鼠皮下腫瘤中EMT 相關(guān)蛋白的表達，取粟粒大小組織至于研缽中，倒入液氮研至粉末狀，加入適量裂解液（根據(jù)說明書要求），迅速將裂解的組織液吸入提前預(yù)冷的EP 管中，冰上充分裂解30 min，每5 min 渦旋振蕩，4 ℃、12 000×g離心5 min。吸取離心后的上清溶液，保存于－80 ℃冰箱。BCA 法檢測蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸5 min。每個泳道上樣量為40 μg，首先以90 V 電壓在濃縮膠中電泳，出現(xiàn)紅色marker 后轉(zhuǎn)為120 V，觀察溴酚藍進入到凝膠的下部邊緣方可終止電泳。電轉(zhuǎn)膜條件，230 mA 轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜溫度4 ℃。免疫反應(yīng)，50 g／L 脫脂奶粉液封閉4 h，置于TBST中洗滌3 次，加入一抗（1 ∶ 1 000 稀釋）室溫孵育2 h，置于TBST 中洗滌3 次，再加入 二抗（1 ∶10 000）室溫孵育80 min，TBST 洗 滌3 次。ECL 化學(xué)發(fā) 光法測 定E?cadherin、Vimentin、Akt、p?Akt 和內(nèi)參GAPDH 條帶的光密值，目的蛋白相對表達量＝目的蛋白光密度值／GAPDH 光密度值。實驗重復(fù)3 次。

2.6 RT? PCR 檢測 檢測小鼠皮下腫瘤中EMT 相關(guān)mRNA 的表達。取粟粒大小組織至于研缽中，倒入液氮研至粉末狀，加入總RNA 提取試劑盒裂解試劑提取RNA，測提取RNA 濃度，并根據(jù)說明書要求體系進行反轉(zhuǎn)錄，步驟同反轉(zhuǎn)錄試劑盒。PCR 引物如表1 所示，采用2－ΔΔCt方法計算E?cadherin、Vimentin 的相對表達量。實驗重復(fù)3 次。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Dunnett?t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組乳腺癌小鼠一般生長狀態(tài)及腫瘤生長曲線 給藥第6、9、12 天，與模型組相比，環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組組腫瘤體積較小，生長速率減緩（P＜0.05）。給藥第15、18、21 天，與模型組對比，環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組腫瘤體積較小，生長速率減緩（P＜0.05）；薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組腫瘤體積較環(huán)磷酰胺組均減小，生長速率均減緩（P＜0.05）。環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組抑瘤率分別為31.9%、45.2%。解剖過程中發(fā)現(xiàn)，模型組乳腺癌小鼠均有肺轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移情況，脾臟體積大、腫瘤體積較大、腹部占位嚴重；環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組腫瘤肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移及腹膜淋巴轉(zhuǎn)移率均低于模型組，腫瘤體積小、腹部各臟腑器官形態(tài)正常無擠壓，造模過程中觀察。模型組小鼠毛色逐漸失去光澤，活動逐漸減少，2 只小鼠下肢被腫瘤包圍吞噬失去活動能力；給藥組小鼠毛色較光澤，小鼠活動度好，生命體征完整。見圖1～2。

圖1 各組小鼠腫瘤體積生長曲線（n＝8）

3.2 各組乳腺癌小鼠瘤重 環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組與模型組相比瘤重較輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組相比環(huán)磷酰胺組瘤重減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組乳腺癌小鼠瘤重比較（）

表2 各組乳腺癌小鼠瘤重比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05。

3.3 薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺對瘤組織EMT 相關(guān)蛋白的影響與模型組比較，環(huán)磷酰胺組、薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組能上調(diào)E?cadherin 蛋白表達（P＜0.05），下調(diào)Vimentin、P?Akt／Akt 蛋白表達（P＜0.05）；與環(huán)磷酰胺組比較，薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺 組 E?cadherin 蛋白表 達增加（P＜0.05），Vimentin、P?Akt／Akt 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖3～4。

圖2 各組乳腺癌小鼠解剖圖

圖3 Western blot 檢測瘤組織E?cadherin、Vimentin、Akt 及P?Akt 蛋白表達

圖4 薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺對瘤組織EMT 相關(guān)蛋白的影響（n＝8）

3.4 薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺對瘤組織EMT 相關(guān)mRNA 表達的影響 與模型組相比，環(huán)磷酰胺組和薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組能上調(diào)E?cadherin mRNA 表達（P＜0.05），下調(diào)Vimentin mRNA 表達（P＜0.05），薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺組較環(huán)磷酰胺組明顯（P＜0.05）。見圖5。

圖5 薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺對瘤組織EMT 相關(guān)mRNA 表達的影響（n＝8）

4 討論

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一，占女性癌癥第一位。近年來乳腺癌發(fā)病率明顯上升［7］，其中腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是威脅患者生命的重要原因，研究［8］表明有淋巴結(jié)累及的患者有更高的乳腺癌特異性死亡風(fēng)險。EMT主要分子特征有細胞上皮表型如E?cadherin 表達下降或缺失，間質(zhì)表型如Vimentin 等間質(zhì)細胞標(biāo)志物表達增強［9］。E?cadherin 介導(dǎo)細胞間黏附，維持細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的穩(wěn)定，其缺失是上皮腫瘤細胞侵襲前提條件。E?cadherin 表達降低則細胞間黏附性下降，細胞脫落擴散，造成腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移［10］。Vimentin 存在于間充質(zhì)細胞中，作為細胞骨架支撐維持細胞形態(tài)，在腫瘤細胞遷移、黏附、EMT 中均發(fā)揮作用［11］。

中醫(yī)認為乳腺癌屬于“乳巖”“乳石癰”等范疇［12］，是機體為七情所傷，引起五臟六腑虛損、氣血不暢、脈阻交結(jié)，外加邪毒侵體，導(dǎo)致氣滯血瘀于乳中而成。

本次探究中發(fā)現(xiàn)薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺對于乳腺癌4T1小鼠中EMT 具有一定的抑制作用，且較單獨使用化療藥明顯，乳腺癌在中醫(yī)臨床治療中更加注重扶正抗瘤［13］，再加上病人放化療之后體虛加劇，故選擇扶正培本的思路解毒扶正抗瘤。薯蕷丸作為醫(yī)圣張仲景驅(qū)邪扶正的代表方，原載于《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》，文中載到：“虛勞諸不足，風(fēng)氣百疾，薯蕷丸主之”?！疤搫谥T不足”即為陰陽氣血俱不足的虛勞病人［14］，放化療之后的病人身體陰陽氣血俱虛，《素問》 有“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”的記載；《醫(yī)宗必讀》 則曰：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”。中醫(yī)對乳腺癌發(fā)病后的經(jīng)絡(luò)、臟腑、陰陽、血氣變化早有翔實全面的認識，且從體質(zhì)、情志因素等方面有著深入的研究，為臨床診治做出很大指導(dǎo)意義［15?18］?！督饏T要略》 記載薯蕷丸中薯蕷三十分，當(dāng)歸、桂枝、神曲、干地黃、豆黃卷各十分，甘草二十八分，人參七分，川芎、芍藥、白術(shù)、麥門冬、杏仁各六分，柴胡、桔梗、茯苓各五分，阿膠七分，干姜三分，白蘞二分，防風(fēng)六分，大棗百枚為膏。整首方劑的配伍，除直接選取健脾益氣的藥對之外，調(diào)暢氣機的藥對，也是通過條達一身之氣機，使臟腑功能恢復(fù)正常，以期達到扶正祛邪的目的，這又與調(diào)和營衛(wèi)、升陽達表之藥的目的不謀而合［19］，最終使人體陰平陽秘，恢復(fù)健康。

綜上所述，薯蕷丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺可以提高化療后小鼠E?cadherin 表達，降低Vimentin、Akt、p?Akt 表達，為今后臨床對于乳腺癌的治療和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的防治提供了新的診療思路。