王瑀譞，曹文富，崔世奎，丁 坤

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016； 2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）是指以關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨硬化和骨贅形成為特征的慢性、進行性關(guān)節(jié)退行性疾病［1］。臨床多見膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，日久出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)畸形，中醫(yī)稱之為“骨痹”?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”。中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎已有悠久歷史，近年多項臨床研究［2?3］再次強調(diào)中藥外用治療KOA 較一般西藥外用治療效果更加明顯。NF?κB信號通路對KOA 的發(fā)展有至關(guān)重要的作用。NF?κB 信號通路激活觸發(fā)了幾種基質(zhì)降解蛋白酶的分泌［4］，如基質(zhì)蛋白降解酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）、具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶家族（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）及其他降解酶過量產(chǎn)生，使關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)（extracellular cartilage matrix，ECM）中聚蛋 白多糖（aggrecan，ACAN）及 II 型膠原（collagen type II，Collagen Ⅱ）發(fā)生降解［5］，最終導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨破壞。本研究以改良Hulth 法制備膝骨關(guān)節(jié)炎模型，基于NF?κB 信號通路探討散寒化痰方外敷治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用及機理。

1 材料

1.1 動物 6 月齡，清潔級新西蘭兔，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證SCXK（粵）2014?0035。

1.2 藥物 散寒化痰方由生川烏、生草烏、生南星、生附子、白芷、樟腦六味中藥組成，將本方做成細粉（100目）；基質(zhì)由松香、石蠟、松節(jié)油、液體石蠟經(jīng)加熱溶解混合而成。將做好的中藥粉與基質(zhì)混合，經(jīng)碾壓成膜，再與膠布復(fù)合而成（配方與藥品由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院提供配制）。低劑量組每15 g 藥膜中含1.5 g 生藥材，中劑量組每15 g 藥膜中含3.0 g 生藥材，高劑量組每15 g 藥膜中含6.0 g 生藥材，雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林軟膏，北京諾華制藥公司生產(chǎn)，國藥準字H19990291，規(guī)格每支20 g）。

1.3 試劑 RNAiso Plus（日本Takara 公司，批號AJ11 037 A）；Hipure Total RNA Plus Mini Kit（廣州美基生物科技有限公司，批號LOT20180913）；037A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司，批號AK6501）；NF?κB p65 抗兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號AH04138226）；MMP?3、MMP?13 抗兔多 克隆抗 體（美 國 Affinity Biosciences 公司，批號30v3370、29q0184）；ADAMTS?5 抗兔多克隆抗體（英國Abcam 公司，批號GR3206699?1）；COL2A1 抗兔多克隆抗體（美國Novus Biologicals 公司，批號3202514C）；SYBR Green I（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號TSE202）；HE 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0105）；Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20180424）；IL?1β ELISA 試劑盒（上海江萊科技有限公司，批號20180826）；TNF?α ELISA試劑盒（上海研域化學(xué)試劑有限公司，批號E20180515?72292A）；DEPC 水（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號08031818091）；各引物由日本Takara 公司合成。

1.4 儀器 透射電鏡（日本Hitachi 公司）；Nano Drop 2000C 超微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo Scientific 公司）；SM 2000R 石蠟切片機（德國Leica 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；TGI?16 離心機（長沙湘儀儀器有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

2.1.1 造模、分組 36 只新西蘭兔隨機分為6 組：正常組、模型組、陽性對照組（扶他林軟膏）及散寒化痰方低、中、高劑量組，每組6 只。一兔一籠進行標準喂養(yǎng)，兔籠大小為300 mm×600 mm×400 mm，允許其在籠內(nèi)自由活動?；旌巷暳衔桂B(yǎng)，自由飲水，每日去除兔糞和食物殘渣，保證飼養(yǎng)環(huán)境清潔。自由飲水進食1 周后開始實驗。除正常組外，其他5 組均以改良Hulth 法［6］復(fù)制膝KOA 模型。術(shù)后每天每只新西蘭兔肌肉注射青霉素2.0×105U，傷口換藥，連續(xù)7 d 以防感染。術(shù)后1 周，每日驅(qū)趕動物運動2 次，共30 min。手術(shù)6 周后，家兔步態(tài)呈明顯跛行，手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)外觀呈明顯腫大變形，獲得兔KOA 模型［7］。造模成功后，每天觀察新西蘭兔的食量、大小便、活動度、步態(tài)及精神狀況。

2.1.2 給藥 術(shù)后6 周開始給藥，正常組、模型組以空白基質(zhì)外貼KOA 側(cè)膝關(guān)節(jié)，每天上午1 次，6 h／次；陽性對照組予扶他林軟膏外涂KOA 側(cè)膝關(guān)節(jié)，每天上午1 次，6 h后用生理鹽水清洗掉；散寒化痰方低、中、高劑量組分別予相應(yīng)散寒化痰方制劑（1.5、3.0、6.0 g 生藥／15 g）外敷KOA 側(cè)膝關(guān)節(jié)，每天上午1 次外敷，6 h／次，連續(xù)6 周。

2.2 取材 藥物干預(yù)6 周后，抽取兔耳靜脈血2 mL，置3 000r／min 離心10 min，取血清。處死新西蘭兔，分別取造模側(cè)膝股骨內(nèi)髁軟骨組織、膝脛骨平臺軟骨組織，部分置于凍存管中－80 ℃凍存；部分取1 mm×1 mm×1 mm 大小組織浸泡于2.5%戊二醛中；其余置10%中性甲醛溶液固定，后經(jīng)脫鈣、脫水，石蠟包埋，待檢測。

2.3 HE 染色 取制備的兔軟骨組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯透化，脫蠟，蒸餾水沖洗后，進行HE 染色，利用倒置顯微鏡觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化，每組切片隨機選取6個視野，進行Mankin’s 評分［8］及統(tǒng)計分析。

2.4 Masson 染色 取制備的兔軟骨組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯透化，脫蠟，蒸餾水沖洗后，進行MASSON 染色，利用倒置顯微鏡觀察膝關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)，每組切片隨機選取6 個視野，使用Image J 軟件計算膠原容積分數(shù)（Collagenvolume fraction，CVF）并進行分析。

2.5 透射電鏡觀察 取浸泡于2.5%戊二醛中的軟骨組織，制備切片，透射電鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)。

2.6 ELISA 法檢測兔血清IL?1β、TNF?α 水平 按照IL?1β、TNF?α 試劑盒說明對制備的兔血清進行檢測。

2.7 Western blot 法檢測兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5、Collagen Ⅱ蛋白表達 RIPA 裂解液提取膝關(guān)節(jié)軟骨組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，配平各蛋白樣品，加樣后進行SDS?PAGE。切下目的蛋白所在PAGE 膠，進行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后用5% 脫脂牛奶進行封閉1 h，加入一抗，搖床4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，5 min／次。室溫下加入二抗孵育30 min，TBST 洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法顯影及成像，讀取灰度值并進行相對表達量的統(tǒng)計分析。

2.8 RT?PCR 檢測兔 膝關(guān)節(jié)軟骨MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5、Collagen ⅡmRNA 表達 液氮環(huán)境下研磨關(guān)節(jié)軟骨，根據(jù)試劑說明書使用RNAiso Plus 和Hipure Total RNA Plus Mini Kit 從兔軟骨組織中提取總RNA；使用037A試劑盒在37 ℃、15 min，85 ℃條件下將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；用ND1000 型核酸蛋白測量儀測RNA 濃度和純度，以cDNA 為模板進行RT?PCR。mRNA 水平標準化為β?actin，使用2－ΔΔCt方法分析相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 免疫組化法檢測NF?κB p65 入核表達 取制備的兔軟骨組織石蠟切片，按照說明步驟逐一進行脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉，37 ℃孵育一抗NF?κB p65 30 min，37 ℃孵育二抗30 min，DBA 顯色、復(fù)染、脫水后封片。每張切片隨機選6 個視野（×400），光鏡下觀察，分析計算平均光密度值。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)（）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗分析；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 肉眼觀察兔膝關(guān)節(jié)，正常組膝關(guān)節(jié)外觀無腫脹、變形，關(guān)節(jié)軟骨面光滑，色澤明亮；造模成功膝關(guān)節(jié)外觀呈明顯膨大、變形，關(guān)節(jié)間隙狹窄，邊緣骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨表面光澤度降低，厚度變薄并伴有不同程度的磨損，伴硬化。見圖1。

圖1 正常組與造模成功后兔膝關(guān)節(jié)一般情況

3.2 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE 染色 正常組兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，細胞排列較規(guī)則，軟骨細胞形態(tài)正常，潮線清晰可見（Mankin’s 評分0～1 分）；模型組兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面明顯缺損，組織出現(xiàn)潰爛，軟骨細胞排列明顯紊亂，大量炎癥細胞浸潤，潮線消失，呈明顯退行性病變（Mankin’s 評分8～12 分）；陽性對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑稍欠佳，表層細胞成簇狀，細胞出現(xiàn)輕度增生，并伴有空泡出現(xiàn)，潮線不清晰（Mankin’s 評分4～7 分）；散寒化痰方低劑量組兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑完整，細胞排列尚整齊，潮線較完整（Mankin’s 評分1～5 分）；散寒化痰方中劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，表層細胞排列規(guī)則，潮線完整（Mankin’s 評分0～4 分）；散寒化痰方高劑量兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，細胞排列規(guī)則，潮線完整（Mankin’s 評分0～3 分），見圖2。Mankin’s 評分見表2。

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理改變（HE，×200）

表2 HE 染色Mankin’s 評分（， n＝6）

表2 HE 染色Mankin’s 評分（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Masson 染色 正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維呈藍色，均勻分布，無斷裂缺失；模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維斷裂缺失嚴重，排列明顯紊亂；陽性對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維較分布均勻，稍有斷裂缺失；散寒化痰方低劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維排列分布均勻平滑，未見明顯斷裂缺失；散寒化痰方中劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維分布尚均勻，局部稍有斷裂；散寒化痰方高劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維分布均勻平滑，未見斷裂缺失，見圖3。CVF 分析見表3。

表3 Masson 染色膠原容積分數(shù)（， n＝6）

表3 Masson 染色膠原容積分數(shù)（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織膠原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)（Masson，×200）

3.4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞超微結(jié)構(gòu) 正常組兔膝軟骨細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常完整，細胞呈卵圓形，表面短小絨毛凸起，細胞核橢圓，染色質(zhì)分布均勻，胞內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；模型組兔膝軟骨細胞形態(tài)不規(guī)整，明顯固縮，部分溶解壞死，可見數(shù)個大體積空洞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解斷裂并伴有高度擴張，細胞結(jié)構(gòu)嚴重破壞；陽性對照組家兔膝軟骨細胞細胞核縮小，異染色質(zhì)固縮，出現(xiàn)脂滴及線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少并伴有擴張；散寒化痰方低劑量組兔膝軟骨細胞形態(tài)正常，細胞核橢圓，染色質(zhì)分布均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量稍減少，少許溶解斷裂，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，少許線粒體腫脹；散寒化痰方中劑量組兔膝軟骨細胞形態(tài)正常，細胞核橢圓，染色質(zhì)分布均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，少許輕度擴張；散寒化痰方高劑量組兔膝軟骨細胞形態(tài)正常，細胞核橢圓，染色質(zhì)分布均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量稍減少，有脂滴出現(xiàn)，其中除正常組，以散寒化痰方中、高劑量組軟骨細胞結(jié)構(gòu)最為完整。見圖4。

圖4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞超微結(jié)構(gòu)（×8 000）

3.5 各組兔血清IL?1β、TNF?α 水平 與正常組比較，模型組兔血清中IL?1β、TNF?α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、散寒化痰方各劑量組兔血清IL?1β、TNF?α 水平均降低（P＜0.01），見表4。

表4 各組兔血清IL?1β、TNF?α 水平（， n＝6）

表4 各組兔血清IL?1β、TNF?α 水平（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.6 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5、Collagen Ⅱ蛋白表達 與正常組比較，模型組MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5 蛋白表達上升（P＜0.05，P＜0.01），Collagen Ⅱ蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、散寒化痰方各劑量組均能下調(diào)MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5 蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01），上調(diào)Collagen Ⅱ蛋白表達（P＜0.01），見圖5。

圖5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5、Collagen Ⅱ蛋白表達（n＝6）

3.7 各組兔 膝關(guān)節(jié)軟骨MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5、CollagenⅡmRNA 表達 與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5 mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Collagen ⅡmRNA 表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，散寒化痰方各劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP?3、MMP?13、ADAMTS?5 mRNA 均表達均下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），散寒化痰方低、高劑量組Collagen ⅡmRNA 表達上調(diào)（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP?3、 MMP?13、 ADAMTS?5、Collagen ⅡmRNA 表達（n＝6）

3.8 免疫組化法檢測NF?κB p65 入核表達 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞均有NF?κB p65 陽性表達，主要定位于細胞核。正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色為棕黃色；模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色呈深棕黃色；陽性對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色呈深棕色；散寒化痰方低劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色為淺棕黃色；散寒化痰方中劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色為淺棕色；散寒化痰方高劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核染色棕黃色較淺。與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨NF?κB p65 入核表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，除陽性對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨NF?κB p65 入核表達增加外，散寒化痰方低、中、高劑量組兔膝關(guān)節(jié)軟骨NF?κB p65入核表達均減少（P＜0.05，P＜0.01），見圖7。

圖7 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織NF?κB p65 入核表達（免疫組化，×400）（n＝6）

4 討論

KOA 是一種進行性膝關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，伴骨質(zhì)增生反應(yīng)的退行性疾病，主要以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙為主要臨床表現(xiàn)［9］。膝關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細胞（chondrocyte）、膠原蛋 白（Collagen）、蛋白聚糖（proteoglycan，PG）和嵌入少量軟骨細胞的其他蛋白質(zhì)的水合細胞外基質(zhì)（extracellular cartilage matrix，ECM）組成的無血管組織。其中ECM 的主要成分為Collagen Ⅱ和ACAN。有文獻表明，Collagen Ⅱ和ACAN 的合成對于軟骨修復(fù)是必需的，ECM 中Collagen Ⅱ和ACAN 合成與降解失衡是造成關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要原因之一。ECM 中Collagen降解主要通過MMPs 進行。MMPs 是一組有20 多個成員的酶活性依賴Zn＋的蛋白水解酶家族，正常情況下受金屬蛋白酶組織抑制因子（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP）的抑制［10?12］，處于無 活性或 低活性狀態(tài)。其 中MMP?3、MMP?13 對Collagen Ⅱ及其他ECM 成分的水解起到關(guān)鍵作用［13］。ADAMTS 是一種與ECM 結(jié)合的分泌型蛋白酶，參與ECM 降解、凝血、炎性病變等多種作用。ADAMTS 在結(jié)構(gòu)和功能上與MMPs 相似，具有降解ECM 和基底膜中的Collagen、ACAN 和纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）等作用［14］。具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶家 族?5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS?5）屬于ADAMTS 家族，有研究表明，ECM 中ACAN 的丟失是KOA 的早期表現(xiàn)，初始階段ADAMTS?5 介導(dǎo)的ACAN 降解使膠原纖維更容易受到膠原酶（Collagenase）的影響，導(dǎo)致KOA 軟骨的膠原基質(zhì)（Collagen matrix，CM）暴露并 被 MMP?3、MMP?13 降解［15?16］。ADAMTS?5、MMP?3 和MMP?13 共同作用，最終導(dǎo)致ECM 降解，軟骨破壞，進而誘 發(fā)KOA。因此抑 制ADAMTS?5、MMP?3、MMP?13 表達，可能對改善KOA 及保護KOA 關(guān)節(jié)軟骨有重要作用。

NF?κB 信號通路作為經(jīng)典的信號傳導(dǎo)通路，參與機體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，能調(diào)節(jié)細胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等，與人類許多疾病如關(guān)節(jié)炎、心臟與腦部疾病以及其他炎癥變化等密切相關(guān)。NF?κB 作為炎癥基因表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由RelA（p65），RelB，Rel，p105／p50 和p100／p52組成。有研究顯示，NF?κB 信號以雙向方式調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)和退化。在正常關(guān)節(jié)軟骨細胞中，其無活性二聚體形式受NF?κB 蛋白抑制劑（IκB）抑制，存在于細胞質(zhì)中，但少量的細胞核內(nèi)Rel A 是轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)抗凋亡所必須的，而抗凋亡基因?qū)τ谲浌羌毎纳媸潜夭豢缮俚模?7］。在受到各種化學(xué)因子、細胞因子信號刺激，如IL?1β、IL?6、TNF?α 過量分泌和膝關(guān)節(jié)機械應(yīng)力改變時，IκB 激酶（IKKs）激活，磷酸化的IκB 蛋白降解，細胞質(zhì)中大量游離的NF?κB 復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞核中，導(dǎo)致NF?κB 信號通路過度激活，誘導(dǎo)一氧化氮（NO），環(huán)氧合酶?2（Cyclooxygenase?2，COX?2）等炎癥代謝因子、MMPs 和ADAMTS 等與KOA 相關(guān)的ECM 降解代謝因子過量產(chǎn)生，進而誘發(fā)膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)以及膝關(guān)節(jié)ECM 降解［18］。同時NF?κB 信號通路過度激活，可持續(xù)刺激IL?1β、TNF?α 等促炎因子產(chǎn)生，反饋作用于NF?κB 信號通路，進一步導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，加速KOA 發(fā)展［19］。

《素問·痹論》中提到：“所謂痹者，各以其時，重感于風(fēng)寒濕之氣也”，強調(diào)了KOA 的發(fā)生與風(fēng)、寒、濕三邪密切相關(guān)。“時”在此指五臟氣旺的季節(jié)。腎氣旺于冬季，寒為冬季主氣，冬季感受三邪，腎先應(yīng)之。寒氣傷腎入骨，使骨重不舉，酸削疼痛，久而關(guān)節(jié)變形，活動受限，形成骨痹。寒濕入侵，淤血阻絡(luò)是絕大多數(shù)骨關(guān)節(jié)炎的外在主要病機。KOA 屬于風(fēng)寒濕痹，初起及進展過程控制應(yīng)從祛風(fēng)散寒除濕著手。散寒化痰方主要由生川烏、生草烏、生南星、生附子、白芷、樟腦組成，這六味藥物具有溫經(jīng)散寒之共性，抗炎鎮(zhèn)痛癥的特點，能發(fā)揮溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)之功。目前KOA 的西藥治療主要以非甾類抗炎藥（如雙氯芬酸二乙胺膠劑外搽、塞來昔布口服等）緩解疼痛為主，其主要通過抑制COX 生成，阻斷PG 合成而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。但有臨床研究表明，外用非甾類抗炎藥治療骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛僅在第1、2 周療效優(yōu)于安慰劑，疼痛減輕的效應(yīng)量分別是0.41 ［95% CI（0.16，0.660）］、0.40 ［95% CI（0.15，0.65）］，而第3、4 周療效與安慰劑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；同時，長期口服非甾類抗炎藥對胃腸道、腎臟等存在一定損傷［20?21］。因此，開發(fā)更有效和安全的KOA 外用治療藥物尤為重要。NF?κB 信號通路廣泛參與了軟骨炎癥、凋亡、降解等生物學(xué)過程，有效的阻斷NF?κB 信號通路傳導(dǎo)是目前中西醫(yī)防治KOA 的的重要思路與方法。因此本研究基于NF?κB 信號通路探討了散寒化痰方制劑外敷治療KOA 的作用及可能機理。

在本研究中，為排除假陽性結(jié)果干擾，加入了正常組和模型組以空白基質(zhì)外敷及陽性對照組扶他林軟膏外搽。結(jié)果顯示，散寒化痰方各劑量組均能有效保護兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)及膝關(guān)節(jié)軟骨細胞結(jié)構(gòu)；下調(diào)兔血清IL?1β、TNF?α 水平，抑制NF?κB p65 入核表達，下調(diào)兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織ADAMTS?5、MMP?3 和MMP?13 蛋白及mRNA 表達，上調(diào)Collagen Ⅱ蛋白及mRNA 表達，從而延緩和控制KOA發(fā)展。綜上所述，散寒化痰方治療兔模型KOA，其作用機理至少部分歸因于對NF?κB 信號通路途徑的阻斷，阻止ECM 降解，進而保護關(guān)節(jié)軟骨。