張 優(yōu)，趙 權(quán)，李 瑤，孫 紅，陳 影，井 汶，居文政

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao 或云連Copti teetaWall.的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，其主要成分生物堿類具有降糖調(diào)脂、抗心律失常、抗菌、抗炎和抗腫瘤等作用［1］。生地為玄參科多年生草本植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的塊根，具有清熱涼血，益陰生津之功效，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)生地化學(xué)成分環(huán)烯醚萜及其苷類具有調(diào)節(jié)血糖、抗胃潰瘍、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等作用［2］。有很多經(jīng)典方中都含有黃連和生地這兩味藥，如清胃散、朱砂安神丸、黃連丸等。并且已有研究報(bào)道單味藥黃連及其組分和復(fù)方以及含生地的復(fù)方有抗抑郁的作用，而黃連發(fā)揮抗抑郁作用主要有效成分鹽酸小檗堿生物利用度較低，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)前期，我們研究發(fā)現(xiàn)大劑量的生地的加入能增加黃連中鹽酸小檗堿的溶出率，這與有關(guān)文獻(xiàn)所述一致［3］。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠抑郁模型，探討生地對(duì)黃連改善LPS 誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為的影響及可能的相關(guān)機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 黃連（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)20190701?01），生地（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，批號(hào)19071817），均由江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任中藥師張倩鑒定為正品。艾司西酞普蘭（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批 號(hào) S0610A）；LPS（美國(guó) sigma公司，批號(hào)019M4009V）；TNF?α（批號(hào) 20200221）、IL?1β（批號(hào)20200216）、IL?6 ELISA（批號(hào)20200216）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0010）；髓樣分化因子88（MyD88）（批號(hào)4283）、核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB）（批號(hào)8242）、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子?κB（p?NF?κB）（批號(hào)3036）抗體（美國(guó)CST 公司）；Toll 樣受體4（TLR4）抗體（批號(hào)AF7017）、山羊抗兔二抗（批號(hào)S0001）、山羊抗鼠二抗（批號(hào)S0002）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號(hào)AF7021）、ECL 型超敏發(fā)光液（批號(hào)KF001）（美國(guó)Affinity 公司）。

1.2 動(dòng)物 54 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2019?0001。

1.3 藥物制備 分別精密稱定黃連、生地藥材各170 g，混合后第1 次用10 倍量的70%乙醇回流提取45 min，第2次用8 倍量的70%乙醇回流提取30 min，提取液用4 層紗布過(guò)濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至170 mL，即得黃連生地合提取液（1 ∶1）（1 mL 提取液含生藥量2 g）。黃連提取液以及黃連生地合提取液（1 ∶8）的制備方法同上（1 mL 提取液含生藥量2 g）。各藥物組的黃連量相同，均為170 g。

1.4 儀器 低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；精密天平（日本島津有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio?Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PH 值檢測(cè)儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；高通道組織勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠抑郁模型建立及給藥 SD 雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，將54 只大鼠根據(jù)體質(zhì)量和糖水偏好率分為空白組、模型組、艾司西酞普蘭組6.3 mg／（kg·d）、黃連組1.67 g／（kg·d）、黃連?生地1 ∶1 組3.34 g／（kg·d）、黃連?生地1 ∶8 組15.03 g／（kg·d）［5］。模型組腹腔注射LPS 0.5 mg／（kg·2 d）［4］，空白組同樣每?jī)商旄骨蛔⑸? 次0.9%氯化鈉，注射容量為5 mL／kg。造模3 周后，糖水試驗(yàn)結(jié)果顯示造模成功，艾司西酞普蘭組按5 mL／kg 腹腔注射給藥，其余5 組灌胃給藥，其中空白組和模型組灌胃等容量的蒸餾水，灌胃容量均為10 mL／kg，連續(xù)灌胃2 周，給藥期間仍需進(jìn)行造模給藥。

1.5.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 在進(jìn)行第1 次糖水實(shí)驗(yàn)之前，先對(duì)所有大鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)，第1 天上午9 點(diǎn)，在每個(gè)籠子上放置2 瓶2%蔗糖水；第2 天同樣時(shí)間，更換為1 瓶含2%蔗糖水和1 瓶純水；第3 天同樣時(shí)間撤掉所有水瓶，禁水禁食24 h；第4 天9 點(diǎn)開(kāi)始正式進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)，給予每只大鼠1 瓶2%蔗糖水和1 瓶純水，測(cè)3 h 的糖水偏好，中間1.5 h 時(shí)兩水瓶換一下位置。此后糖水偏好實(shí)驗(yàn)不需進(jìn)行糖水適應(yīng)，但仍需禁水禁食24 h，糖水偏好率＝（糖水消耗量／總液體消耗量）×100%。

1.5.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm的游泳玻璃容器中，水溫為常溫，水的高度25 cm 左右，保證大鼠爪不觸及容器底面并且不會(huì)跳出容器外。游泳時(shí)間為5 min，后4 min 記錄大鼠不動(dòng)時(shí)間，以大鼠漂浮在水面無(wú)掙扎為不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.4 敞箱實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)時(shí)，每只大鼠在同一位置放入50 cm×50 cm×50 cm 實(shí)驗(yàn)箱，同時(shí)對(duì)大鼠活動(dòng)進(jìn)行攝像，記錄5 min 內(nèi)大鼠的水平、垂直活動(dòng)和修飾次數(shù)，每只大鼠測(cè)試完之后清理干凈排泄物并用75%酒精擦拭，以穿越格數(shù)（3 爪以上立在1 格）計(jì)水平得分，以直立數(shù)（大鼠兩前肢離地）計(jì)垂直得分，以理毛或洗臉數(shù)計(jì)修飾得分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)均為1 次1 分。

1.5.5 ELISA 檢測(cè) 取大鼠前額皮質(zhì)和血清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF?α、IL?1β 及IL?6。

1.5.6 Western blot 檢測(cè) 稱取大鼠前額皮質(zhì)適量，加入10 倍體積的勻漿介質(zhì)提取蛋白，8 000 r ／min 離心20 min，并按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定組織勻漿上清液中蛋白濃度為0.5 μg／μL。配置10% 分離膠，先80 V電泳20 min，再用120 V 電泳1 h。200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜70 min。封閉液封閉1 h，分別搖床孵育一抗（TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 稀釋比均為（1 ∶1 000）及GAPDH（1 ∶3 000），4 ℃過(guò)夜。TBST 沖洗3 次，10 min／次，孵育二抗（稀釋比1 ∶5 000）1 h，TBST 沖洗3 次，10 min／次，ECL發(fā)光并進(jìn)行相應(yīng)的圖像采集處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)均用（）表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)糖水偏好率的影響 與正常組比較，模型組糖水偏好率降低（P＜0.01）；與模型組比較，艾司西酞普蘭組、黃連組以及黃連?生地1 ∶8 組糖水偏好率升高（P＜0.05，P＜0.01），以艾司西酞普蘭組最為顯著（P＜0.01），黃連?生地1 ∶1 組無(wú)變化（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 與正常組比較，模型組游泳不動(dòng)時(shí)間增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組游泳不動(dòng)時(shí)間均減少（P＜0.05，P＜0.01），艾司西酞普蘭組和黃連?生地1 ∶8 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 對(duì)敞箱得分的影響 與正常組比較，模型組在敞箱實(shí)驗(yàn)中總分降低（P＜0.01）；與模型組比較，艾司西酞普蘭組、黃連組及其與生地配伍組均可提高敞箱實(shí)驗(yàn)總分（P＜0.01），其中黃連組和黃連?生地1 ∶1 組作用相當(dāng)。見(jiàn)表1。

表1 生地對(duì)黃連抗LPS 抑郁大鼠行為學(xué)的影響（， n＝9）

表1 生地對(duì)黃連抗LPS 抑郁大鼠行為學(xué)的影響（， n＝9）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對(duì)血清和前額皮質(zhì)中TNF?α、IL?1β 及IL?6 的影響與正常組比較，模型組血清和前額皮質(zhì)中TNF?α、IL?1β 和IL?6 的水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連組、黃連?生地1 ∶8 組以及艾司西酞普蘭組能夠抑制血清和前額皮質(zhì) 中TNF?α、IL?1β 和IL?6 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）；黃連?生地1 ∶1 組血清和前額皮質(zhì)中IL?6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清中TNF?α 水平下降（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清和前額皮質(zhì)中TNF?α、IL?1β 及IL?6 水平（， n＝9）

表2 各組大鼠血清和前額皮質(zhì)中TNF?α、IL?1β 及IL?6 水平（， n＝9）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 對(duì)前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 的磷酸化水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連?生地1 ∶1 組可降低前額皮質(zhì)中TLR4 及NF?κB 的磷酸化的蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；黃連組、黃連?生地1 ∶8 組以及艾司西酞普蘭組能夠下調(diào)前額皮質(zhì)中TLR4 和MyD88 的蛋白表達(dá)及NF?κB 的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以艾司西酞普蘭組和黃連組最為顯著。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 LPS 大鼠前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)電泳

表3 各組大鼠前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)（， n＝3）

表3 各組大鼠前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

目前，關(guān)于抑郁癥的神經(jīng)和分子機(jī)制主要有單胺遞質(zhì)假說(shuō)、炎癥免疫假說(shuō)、氧化應(yīng)激假說(shuō)以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)［6］。基于炎癥免疫假說(shuō)，通過(guò)注射LPS 誘導(dǎo)抑郁炎癥模型已有很多相關(guān)報(bào)道［4，7?8］。同時(shí)有文獻(xiàn)［5］基于黃連和生地能抑制細(xì)胞的凋亡和炎癥因子的表達(dá)來(lái)研究黃連和生地不同配伍比例時(shí)黃連丸對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病的影響，其中黃連?生地1 ∶8 為綜合藥理作用最好的配伍比例。而LPS誘導(dǎo)抑郁炎癥模型和通過(guò)注射鏈脲佐菌素致糖尿病在炎癥因子上有一定共性，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黃連、經(jīng)典方黃連丸中黃連和生地配伍比例1 ∶1 以及文獻(xiàn)報(bào)道治療糖尿病藥效最強(qiáng)的配伍比例1 ∶8 來(lái)考察生地對(duì)黃連抗LPS 誘導(dǎo)的抑郁作用的影響。

糖水偏好率、敞箱得分、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間是抑郁模型常用的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，即體現(xiàn)抑郁癥快感缺失、運(yùn)動(dòng)不能及行為絕望等特點(diǎn)。TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎性細(xì)胞因子相較于其它炎性細(xì)胞因子與抑郁癥的關(guān)系更為密切［9?11］。TLR4 是Toll 樣天然免疫受體家族中重要成員之一，參與免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞等的宿主防御功能的表達(dá)［12］。NF?κB 是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的炎癥因子釋放的核心因子，由P50 和P65 兩個(gè)亞基組成二聚體并與其抑制蛋白（Iκ?B）以無(wú)活性狀態(tài)存在于胞液當(dāng)中，當(dāng)受到外界因素刺激時(shí)，Iκ?B 發(fā)生磷酸化，促使NF?κB 二聚體解離，NF?κB p65 入核并激活炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子的釋放［13?14］。My D88 既是TLR4 的一個(gè)重要的下游轉(zhuǎn)接蛋白，同時(shí)也是NF?κB 信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白［15］。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠腹腔注射LPS 建立大鼠炎癥抑郁模型，TLR4 識(shí)別出LPS 發(fā)生活化并經(jīng)My D88 依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促使NF?κB p65 入核并磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎性因子的表達(dá)和大鼠抑郁樣行為來(lái)研究黃連及其與生地配伍的抗抑郁作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠糖水偏好率和敞箱實(shí)驗(yàn)總分下降，游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，這提示LPS 誘導(dǎo)作為經(jīng)典抑郁模型成功建立。各給藥組可以改善LPS 誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為，抑制大鼠血清和前額皮質(zhì)中TNF?α、IL?1β、IL?6 的分泌 并下調(diào) 前額皮質(zhì)中TLR4、MyD88、NF?κB 的磷酸化水平，其中黃連組抗抑郁綜合療效最顯著，黃連和生地配比1 ∶8 次之。這與文獻(xiàn)報(bào)道的相比單味黃連，黃連和生地配比1 ∶8 為治療糖尿病效果最優(yōu)結(jié)果不完全一致，考慮可能是由于兩實(shí)驗(yàn)造模給藥以及造模模型不相同所致。所以黃連可以發(fā)揮抗抑郁作用，這可能與TLR4／MyD88／NF?κB 介導(dǎo)的抗抑郁的作用機(jī)制有關(guān)，但生地的加入對(duì)于單味黃連抗抑郁作用無(wú)協(xié)同增效作用。