李國峰，張武崗，郭瑩帆，蔡錦洪，梁新麗*，陳海芳*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004）

消癌平口服液是由通關(guān)藤藥材精制提取而成的中藥單方制劑。研究表明，消癌平對食管癌［1］、胃癌［2］以及肺癌［3］等癌癥有抗癌活性。然而在臨床應(yīng)用中，消癌平常與一線化療藥物順鉑［4］、吉非替尼［5］、紫杉醇［6］等聯(lián)合應(yīng)用居多，單獨用于抗癌治療較少。其原因可能與其所含藥效成分甾體皂苷類，生物利用度低有關(guān)。將引經(jīng)藥與化療藥合用，即“引經(jīng)化療”［7］，擬通過提高治療藥物靶區(qū)的藥物濃度，進而提升藥物化療效果，是當(dāng)前惡性腫瘤治療中的一條新途徑、新方法。研究證實，許多引經(jīng)藥物包括冰片、川芎等引經(jīng)藥物可促進抗腫瘤藥物順鉑、甲氨蝶呤和替莫唑胺在病變區(qū)的分布［8?10］。那么，是否可通過配伍引經(jīng)藥促進消癌平提升抗癌藥效則是本文的研究目的。

桔梗湯出自《金匱要略》，由桔梗、甘草二味藥組成，是治療肺癰的有效處方。同時，李時珍在《本草綱目》 中指出，桔梗為肺部引經(jīng)藥，與甘草同行，可做舟楫之劑［11］。前人研究桔梗湯中的成分桔梗配伍化療藥可起到引經(jīng)增效作用。李揚等［12］發(fā)現(xiàn)桔梗可增加順鉑原位肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的分布，提升順鉑抗癌作用。桔梗配伍乳移平可能通過調(diào)節(jié)CXCL12／CXCR4 生物學(xué)軸及癌基因HER?2 抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展［13］。本研究基于lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，考察消癌平口服液配伍桔梗湯前后對荷瘤小鼠體質(zhì)量變化、小鼠外周血常規(guī)、小鼠血清中IL?2、IL?10 的含量以及腫瘤體積和抑瘤率的影響，以期闡明桔梗湯配伍消癌平的解毒增效作用機制。

1 材料

1.1 儀器 酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)好器械廠，型號LDZX?30KBS）；低速離心機（上海飛鴿股份有限公司，型號800B）；超凈工作臺［日本Sanyo 公司，型號MCV?B161S?（T）］；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；顯微鏡（德國Leika 公司，型號DMI3000B）；小動物血細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號BC?2800vet）；血球儀（瑞士Swelab公司，型號Autocounter 900＋）；3?18K 型高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）。

1.2 藥物與試劑 消癌平口服液（湖北鳳凰白云山藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20060319）；桔梗飲片（安徽濟善堂中藥科技有限公司，批號20170518）；甘草飲片（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號20170427）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國HyClone 公司）；胎牛血清（FBS）（美國Gemine 公司）；青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Genview 公司，批號20170327）；小鼠IL?2 ELISA 試劑盒（批號A202H90532），小鼠IL?10 ELISA 試劑盒（批號A210904141）。

1.3 動物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016?0002］。

1.4 細胞株 Lewis 肺癌細胞株購自美國ATCC 細胞庫，編號36470TM。

2 方法

2.1 桔梗湯水提液的制備 準確稱取桔梗、甘草飲片各30.0 g，加入10 倍體積的雙蒸水浸泡30 min 后加熱煮沸，開始用強火，沸騰后改用文火，保持微沸1 h，攪拌，趁熱過濾，藥渣再加蒸餾水同法煮沸后1 h，濾過。合并濾液，經(jīng)濃縮，最后用雙蒸水定容至250 mL 容量瓶中，密封，放置4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型的制備 取所培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期Lewis 肺癌細胞，PBS 清洗2 次后，加胰蛋白酶2 mL消化后終止，1 000 r／min 離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基吹打細胞制成細胞懸液，細胞計數(shù)后，用DMEM 高糖培養(yǎng)基配制成濃度為5×106／mL的單細胞懸液備用。每只C57BL／6 小鼠右前肢腋下皮下注射0.2 mL 細胞懸液構(gòu)建Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。注射后的C57BL／6 小鼠繼續(xù)按正常情況飼養(yǎng)，每天觀察小鼠接種后的生活狀態(tài)及皮下出瘤情況。

2.3 分組及給藥 接種10 d 左右，注射部位可見皮下腫瘤，腫瘤外觀近似圓形或橢圓形，選取腫瘤直徑為2～3 mm的荷瘤小鼠隨機分6 組，每組10 只，分別為模型組（生理鹽水）、消癌平口服液組（7.8 mL／kg）、低劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋1.3 g 生藥／kg 桔梗湯）、中劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋2.6 g 生藥／kg 桔梗湯）、高劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋5.2 g 生藥／kg 桔梗湯）、桔梗湯組（2.6 g 生藥／kg 桔梗湯）。連續(xù)給藥2 周。另設(shè)正常組：常規(guī)飼養(yǎng)。

2.4 小鼠生存狀態(tài)觀察 每天觀察給藥后小鼠的活動狀態(tài)，進水飲食量，毛發(fā)色澤，有無死亡情況以及體質(zhì)量變化。

2.5 瘤體積和抑瘤率測定 在給藥干預(yù)期間，每隔一天用游標(biāo)卡尺測量小鼠瘤徑，計算瘤體積。末次給藥24 h 后頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織稱重。有效率為藥物抑瘤率≥60%的小鼠數(shù)量占本組小鼠總數(shù)中的比例。瘤體積V（mm3）＝a×b2／2 （a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑），抑瘤率＝ ［（模型組瘤重－給藥組瘤重）／模型組瘤重］ ×100%。

2.6 小鼠臟器指數(shù)測定 末次給藥24 h 后稱重，采血后，小鼠脫頸椎處死，解剖并取出小鼠心臟，肝臟，脾臟，肺臟和腎臟組織并稱重。臟器指數(shù)（mg／g）＝臟器質(zhì)量（mg）／處死當(dāng)日體質(zhì)量（g）×100。

2.7 小鼠外周血常規(guī)的檢測 小鼠在末次給藥24 h 后，對各組C57BL／6 小鼠進行靜脈眼眶取血，每只取0.2 mL置于含EDTA?2 K 的1.5 mL 離心管中，混勻，采用全自動血液分析儀對白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）、血紅蛋白（HGB）進行測定。

2.8 小鼠血清中細胞免疫因子IL?2 和IL?10 的測定 血標(biāo)本凝集30 min，以1 000×g離心10 min 后吸取血清，嚴格按照ELISA 試劑盒步驟和方法進行操作。使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測，測定在450 nm 最大吸收波長和570 nm 或630 nm參考波長下得OD。繪制出標(biāo)準曲線的直線回歸方程，計算出白細胞介素2（IL?2）、白細胞介素10（IL?10）水平。

2.9 統(tǒng)計分析 采用Graphpad Prism 5.0 軟件作圖并統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以（），多組間比較采用單因素方差分析（One?way ANOVE），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的生活狀態(tài) 對C57BL／6 小鼠觀察發(fā)現(xiàn)，接種后第1 周，各組小鼠活動正常，無明顯變化，精神尚可，毛色無明顯變化。第2 周，空白組小鼠活躍，精神尚可，毛色正常，飲水、進食量正常；模型組小鼠活動明顯減弱，精神不振，飲水，進食量明顯減少，毛色無光澤；消癌平組小鼠毛質(zhì)較粗糙，精神一般，飲水、進食量減少，毛色無光澤；聯(lián)合給藥組活動減弱，精神一般，飲水、進食量減少，毛色無光澤。

3.2 桔梗湯聯(lián)用前后對小鼠體重的影響 由于小鼠飼養(yǎng)后期腫瘤增長快速，其瘤子的變化超過體質(zhì)量變化，因此，為了更準確衡量藥物干預(yù)對體質(zhì)量的影響，在連續(xù)給藥干預(yù)兩周后頸椎脫臼法處死小鼠，去除腫瘤組織后，對干預(yù)前后的小鼠稱定質(zhì)量，與正常組比較，模型組荷瘤小鼠體質(zhì)量下降（P＜0.01），消癌平治療后體質(zhì)量上升（P＜0.05），聯(lián)合桔梗湯后，聯(lián)合用藥組均上升（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化（n＝10）

3.3 小鼠腫瘤體積及抑制率 本實驗以治療藥物的抑瘤率＞60%為標(biāo)準認為藥物有效，本實驗消癌平組抑瘤率大于60%的比例為18%，低劑量聯(lián)合組和中劑量聯(lián)合組抑瘤率大于60%的比例達到27%，而高劑量聯(lián)合組抑瘤率大于60%的比例可達到45%，見表1。連續(xù)給藥14 d 后，與模型組比較，消癌平組瘤體積并沒有減??；而與桔梗湯聯(lián)用后，小鼠瘤體積減少，與消癌平組或模型組相比較，高劑量組瘤體積均減?。≒＜0.05），見圖2，治療結(jié)束后剝離瘤組織，見圖3。該結(jié)果表明，隨著桔梗湯劑量的提高，桔梗湯可明顯提升消癌平藥物抗肺癌作用。

表1 各種藥物的抑瘤情況（n＝10）

圖2 各組小鼠腫瘤體積變化（n＝10）

圖3 各組小鼠腫瘤實物圖

3.4 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對臟器指數(shù)的影響 由圖4 可以看出，荷瘤小鼠藥物前后的心、肝、肺及腎的臟器指數(shù)變化不大。然而對于臟器脾，研究發(fā)現(xiàn)，相比正常組，模型組荷瘤小鼠脾有一定程度肥大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)消癌平治療，與正常組比較脾肥大（P＜0.01），經(jīng)桔梗湯配伍后，低劑量組和中劑量組肥大趨勢下降，但差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而高劑量桔梗湯與消癌平合用后，肥大現(xiàn)象下降趨勢明顯，與正常組比較無差異（P＞0.05）。

圖4 各組小鼠臟器指數(shù)變化（n＝10）

3.5 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對血常規(guī)的影響 由圖5 可以看出，與正常組比較，荷瘤組小鼠WBC 上升（P＜0.05），其原因可能是荷瘤小鼠免疫力下降，感染所致產(chǎn)生炎癥。另外，與正常組小鼠比較，荷瘤組小鼠RBC 和HGB 均下降（P＜0.05，P＜0.01），消癌平組和配伍組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常組比較，模型組小鼠PLT 有下降趨勢，但是差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，但經(jīng)消癌平治療后，PLT 下降（P＜0.05）。而當(dāng)消癌平與桔梗湯聯(lián)用后，與消癌平組比較，低、中、高劑量組PLT 水平上升（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠血常規(guī)變化（n＝10）

3.6 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對細胞因子IL?2、IL?10 的影響 由圖6 可以看出，與正常組比較，模型組IL?10 水平升高（P＜0.05），而且經(jīng)消癌平治療后，與正常組比較，消癌平組IL?10 水平升高（P＜0.01），與模型組比較有升高趨勢。而桔梗湯與消癌平配伍合用后，與模型組比較，中、高劑量組IL?10 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。與消癌平組比較，不同劑量聯(lián)用組IL?10 水平均降低（P＜0.01）。另外桔梗湯單獨使用小鼠的IL?10 水平與模型組比較降低（P＜0.05），較消癌平組也降低（P＜0.01），結(jié)果進一步表明，配伍組降低IL?10 水平可能主要與桔梗湯有關(guān)。另外，對于Il?2 水平來說，與正常組比較，荷瘤組相對較低，但均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，桔梗湯和消癌平合用后IL?2 水平與消癌平或模型組比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 各組小鼠IL?10、IL?2 水平變化（n＝10）

4 討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，當(dāng)前對癌癥患者最主要的治療手段仍以手術(shù)為主，術(shù)后康復(fù)仍需以化療及藥物治療。然而，患者術(shù)后耐受性較低，對癌癥的治療，化療藥物的治療效果卻并不盡人意，多藥耐藥（MDR）嚴重，除對病變部位作用外，還損害正常組織和免疫功能，預(yù)后較差，生活質(zhì)量指數(shù)下降嚴重，究其原因主要為藥物在體內(nèi)分布廣泛，靶向性差有關(guān)。因此，在保證其療效情況下，提升治療藥物的靶向性并盡可能減少不良反應(yīng)是當(dāng)前臨床研究中的重點和難點。中藥的引經(jīng)作用與現(xiàn)代制藥理論的靶向作用十分類似，可通過抑制P?糖蛋白促進藥物吸收［14?15］。因此，引經(jīng)化療是當(dāng)前在癌癥治療過程中提出的有效治療模式，根據(jù)腫瘤所在部位，服用相應(yīng)的引經(jīng)藥配合治療來增加療效等［7］。如鼻咽腫瘤用辛夷、白芷、蒼耳子引經(jīng)，腦腫瘤則僵蠶、全蝎以引藥入腦，肺癌用桔梗、白果，乳腺癌用瓜蔞、山慈菇，胃癌用半枝蓮、白術(shù)［16］。桔梗湯不僅為舟楫之劑，亦為治肺癰之方，因此，本文推測桔梗湯有引導(dǎo)增強消癌平抗癌藥物的抗癌作用。

機體的免疫狀態(tài)跟腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。脾是跟免疫密切相關(guān)的臟器，在許多研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤經(jīng)化療后存在脾肥大問題［17?18］。而本實驗中發(fā)現(xiàn)Lewis 肺癌荷瘤組小鼠普遍存在脾臟肥大現(xiàn)象，在模型組中荷瘤小鼠脾肥大趨勢，且經(jīng)消癌平治療后肥大現(xiàn)象加劇，但是與桔梗湯聯(lián)合后脾肥大現(xiàn)象減輕。另外，輔助性T 細胞（Helper T cells，Th）對機體的特異性和非特異性免疫均具有重要調(diào)節(jié)作用，其分泌的細胞因子是抗腫瘤、促腫瘤的各環(huán)節(jié)的重要“信使”。Th 細胞主要分為Th1、Th2 兩種細胞，其中Th1 細胞參與細胞免疫，其分泌IL?2、IFN?γ 介導(dǎo)細胞免疫，主要發(fā)揮免疫防御作用；Th2 細胞分泌的IL?4、IL?10 介導(dǎo)體液免疫，在多種細胞組織中具有免疫刺激功效及免疫抑制作用，其中IL?10 通常在癌患者中呈高表達［19?20］。正常情況下，Th1 ／Th2 細胞因子處于動態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)機體免疫。因此，在癌癥治療過程中，維持Th1／Th2 細胞因子比例增加有利于腫瘤患者的恢復(fù)。而中藥在腫瘤治療通過維持Th1／Th2 平衡發(fā)揮著免疫調(diào)控作用［21?22］。本實驗中發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠IL?2 水平有下降趨勢，但IL?2 水平整體上與正常組比較無明顯差異，而IL?10 的水平卻顯著升高。桔梗湯有提升IL?2 的作用趨勢，但是與荷瘤組比較，IL?2 水平差異不大；而桔梗湯與消癌平聯(lián)用后，IL?10 水平卻顯著降低，這表明桔梗湯可能通過抑制IL?10 水平維持Th1 和Th2 的平衡，從而抑制腫瘤生長，減少轉(zhuǎn)移。

腫瘤相關(guān)性貧血（cancer related anemia，CRA）為惡性腫瘤常見并發(fā)癥，約有30%～90% 的患者會出現(xiàn)貧血，且與腫瘤惡性程度、類型及治療方案有密切關(guān)系［23?24］。CRA 的發(fā)病機制較復(fù)雜，可能與腫瘤組織浸潤或者放化療藥物毒副作用造成的骨髓損傷、骨髓抑制相關(guān)。由腫瘤或其治療引起的貧血可致血液的攜氧能力降低，進一步導(dǎo)致腫瘤缺氧，從而進一步促使腫瘤通過克隆選擇和基因組改變增加惡性進展和攻擊性［25］。因此，糾正CRA 和PLT 減少，提升患者的生活質(zhì)量是當(dāng)前腫瘤臨床工作的重要工作。中西醫(yī)合用已經(jīng)證實可以緩解藥物化療所帶來的副作用，提升病人的幸福指數(shù)。本實驗中，與正常組比較，荷瘤組小鼠整個造血功能和免疫功能發(fā)生了變化，有紅細胞生成不足、血紅蛋白偏低以及血小板降低等營養(yǎng)不良現(xiàn)象。這種現(xiàn)象提示可能與腫瘤細胞侵犯骨髓有關(guān)，從而正常的造血組織被替代，導(dǎo)致紅細胞生成不足、血紅蛋白偏低以及血小板生成減少等現(xiàn)象。另外本實驗中發(fā)現(xiàn)，化療藥物消癌平可進一步加劇PLT 的下降，而桔梗湯的聯(lián)合，盡管對RBC、HGB 水平僅有提升趨勢，但是卻顯著提升了PLT 的水平，改善了消癌平化療后產(chǎn)生的血小板減少的癥狀，表明桔梗湯可能協(xié)同消癌平提升免疫力作用進而增強消癌平的抗肺癌作用。然而，桔梗湯是否也通過引經(jīng)提升消癌平藥效成分的血藥濃度進而增強抗肺癌作用仍需實驗進一步確認。