張秀花，劉艷平，任仲麗，曲國晶

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤 274000）

連花清瘟膠囊收載于《中國藥典》 一部［1］，由連翹、金銀花、板藍(lán)根等13 味中藥加工而成，方中連翹、金銀花等具有抗菌作用［2?3］，治療細(xì)菌性肺炎和急性上呼吸道感染取得了良好效果［4?6］，2020 年4 月它被批準(zhǔn)用于治療新冠肺炎。目前，全球疫情蔓延，嚴(yán)重威脅人類健康，故連花清瘟膠囊的質(zhì)量倍受關(guān)注。

為了保證臨床用藥安全，各國藥典對口服制劑的微生物污染狀況都有明確質(zhì)控指標(biāo)［7?11］。在原輔料、生產(chǎn)工藝、設(shè)施環(huán)境等可控的條件下，微生物污染菌的檢出主要體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)節(jié)上，開展方法學(xué)適用性試驗(yàn)是做好微生物限度檢查的重點(diǎn)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過各試驗(yàn)菌回收比及控制菌檢查方法試驗(yàn)，建立了連花清瘟膠囊微生物限度檢查方法，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 連花清瘟膠囊購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號A1908063、A2001273、A2001105。

1.2 培養(yǎng)基、稀釋液 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA（批號190518）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA（批號190625）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB（批號190712）、pH7.0 無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液（批號190206）均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌 ［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，經(jīng)專家鑒定合格，而且均為第3 代。

1.4 儀器 電子天平（HZT?A600，福州華志科學(xué)儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（mlS?3781L?PC，三洋工業(yè)株式會社）；生物安全柜（ClassⅡBSC，新加坡ESCD 公司）、細(xì)菌濁度分析儀（WGZ?2XJ，上海盺瑞儀器儀表有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP?420，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

2 方法

2.1 菌液制備 按文獻(xiàn)［12］ 報道，將“1.3”項(xiàng)下菌種制成濃度不大于10 000 cfu／mL 的菌懸液，即得。

2.2 供試液制備 按文獻(xiàn)［12?13］ 報道，將“1.1”項(xiàng)下樣品依次按1 ∶10、1 ∶20、1 ∶50 比例稀釋，即得。

2.3 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 常規(guī)法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加到“2.2”項(xiàng)下1 ∶10 供試液9.9 mL 中，混勻，作為試驗(yàn)組；取稀釋液0.1 mL，加到“2.2”項(xiàng)下1 ∶10 供試液9.9 mL 中，混勻，作為供試品組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加到稀釋液9.9 mL中，混勻，作為菌液對照組。取上述試液各2 mL注皿（1 mL／皿），加入15～20 mL 溫度不超過45 ℃熔化的TSA 或SDA 培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，計算平均菌落數(shù)。

2.3.2 增加稀釋液法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，分別加到“2.2”項(xiàng)下1 ∶20、1 ∶50 供試液9.9 mL 中，混勻，作為試驗(yàn)組，其他同“2.3.1”項(xiàng)，取2 mL 注皿（1 mL／皿），加入15～20 mL 溫度不超過45 ℃熔化的TSA 或SDA 培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，計算平均菌落數(shù)。

2.3.3 增加培養(yǎng)基體積法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加到“2.2”項(xiàng)下1 ∶10 供試液9.9 mL 中，混勻，作為試驗(yàn)組，其他同“2.3.1”項(xiàng)，取1 mL 注皿（0.5、0.2 mL／皿），加入15～20 mL 溫度不超過45 ℃熔化的TSA 或SDA 培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，計算平均菌落數(shù)。

2.3.4 增加稀釋液?增加培養(yǎng)基體積聯(lián)合法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加到“2.2”項(xiàng)下1 ∶20、1 ∶50 供試液9.9 mL 中，混勻，作為試驗(yàn)組，其他同“2.3.1”項(xiàng)，分別取1、2 mL 注皿（0.2、0.4、0.5 mL／皿），加入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA 或SDA 培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，計算平均菌落數(shù)。

2.4 回收比計算 公式為試驗(yàn)組回收比＝（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）／菌液對照組平均菌落數(shù)、稀釋劑對照組回收比＝稀釋劑對照組平均菌落數(shù)／菌液對照組平均菌落數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 預(yù)試驗(yàn) 在文獻(xiàn)［14?21］ 基礎(chǔ)上，首先采用常規(guī)法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，測定5 種菌株回收比，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果見表1。由此可知，常規(guī)法3 批樣品中枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收比均小于0.5，表明對這2 種菌株均有較強(qiáng)抑制作用，可作為需氧菌總數(shù)計數(shù)方法測定的敏感菌株；霉菌酵母菌計數(shù)時，各試驗(yàn)菌回收比均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，符合《中國藥典》 要求，可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

表1 常規(guī)法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3.2 需氧菌計數(shù)方法確定 根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下結(jié)果，選用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌作為敏感菌株，按“2.3.2”至“2.3.4”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果見表2～3。由此可知，稀釋倍數(shù)不同，敏感菌株回收比有顯著差異；增加稀釋液法1 ∶20（1 mL／皿）、增加培養(yǎng)基體積法1 ∶10（0.5 mL／皿）供試液中樣品濃度相同，稀釋倍數(shù)為20 倍，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收比均小于0.5，表明該濃度下供試液仍具有一定抑菌性；增加稀釋液法1 ∶50（1 mL／皿）、增加培養(yǎng)基體積法1 ∶10（0.2 mL／皿）、增加稀釋液?增加培養(yǎng)基體積聯(lián)合法1 ∶20（0.4 mL／皿）供試液中樣品濃度相同，稀釋倍數(shù)為50 倍，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收比均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，表明該濃度下供試液抑菌作用已消除；增加稀釋液?增加培養(yǎng)基體積聯(lián)合法1 ∶20（0.2 mL／皿）、1 ∶50（0.5 mL／皿）供試液中樣品濃度相同，稀釋倍數(shù)為100 倍，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收比均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，表明該濃度下供試液抑菌作用已消除，與稀釋倍數(shù)為50 倍時各試驗(yàn)菌回收比基本一致。最終，選擇稀釋倍數(shù)50 倍時增加稀釋液法1 ∶50（1 mL／皿）、增加培養(yǎng)基體積法1 ∶10（0.2 mL／皿）、增加稀釋液?增加培養(yǎng)基體積聯(lián)合法1 ∶20（0.4 mL／皿）進(jìn)行需氧菌計數(shù)方法試驗(yàn)。

表2 枯草芽孢桿菌回收比試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

表3 金黃色葡萄球菌回收比試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3.3 正式試驗(yàn) 根據(jù)“3.1”和“3.2”項(xiàng)下結(jié)果，需氧菌計數(shù)按“2.3.2”至“2.3.4”項(xiàng)下方法操作，霉菌酵母菌計數(shù)按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果見表4～5，可知3批樣品5 種菌株回收比均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，符合《中國藥典》 要求［12］。最終確定，需氧菌總數(shù)測定可采用增加稀釋液法，1 ∶50 供試液注皿（1 mL／皿），也可采用增加培養(yǎng)基體積法，1 ∶10 供試液注皿（0.2 mL／皿）；霉菌酵母菌總數(shù)測定可采用常規(guī)法，1 ∶10供試液注皿（1 mL／皿），此時各試驗(yàn)菌回收比均符合 《中國藥典》 要求，方法可行。

表4 連花清瘟膠囊方法適用性試驗(yàn)結(jié)果Ⅰ（n＝3）

3.4 控制菌檢查

3.4.1 常規(guī)法 取“2.2”項(xiàng)下1 ∶10 供試液10 mL，加到100 mL TSB 中，混勻，作為供試品組；取“2.2”項(xiàng)下1 ∶10 供試液10 mL、“2.1”項(xiàng)下大腸埃希菌0.1 mL，加到100 mL TSB 中，混勻，作為試驗(yàn)組；取稀釋液10 mL，加到100 mL TSB 中，作為陰性組，按照文獻(xiàn)［12］ 報道的方法檢查。結(jié)果見表6。

表5 連花清瘟膠囊方法適用性試驗(yàn)結(jié)果Ⅱ（n＝3）

3.4.2 稀釋法 取“2.2”項(xiàng)下1 ∶20 供試液10 mL，加到100 mL TSB 中，混勻，作為供試品組；取“2.2”項(xiàng)下1 ∶20 供試液10 mL、“2.1”項(xiàng)下大腸埃希菌0.1 mL，加到100 mL TSB 中，混勻，作為試驗(yàn)組；取稀釋液10 mL，加到100 mL TSB 中，混勻，作為陰性組，按照文獻(xiàn)［12］報道的方法檢查。取“2.2”項(xiàng)下1 ∶50 供試液依法操作，結(jié)果見表6。

表6 控制菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3.4.3 結(jié)果分析 常規(guī)法、稀釋法均檢出陽性菌，而陰性組均無菌落生長，表明可用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查。

4 討論

微生物限度檢查是評價藥品安全性的重要手段，是對藥品中已有微生物污染菌的再現(xiàn)，也是客觀衡量藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)，其操作過程受人、機(jī)、料、法、環(huán)等諸多因素影響，工作量大、重復(fù)勞動多［19?20，22?23］。因此，對同一品種建立合理有效的適用性試驗(yàn)尤其重要。

研究表明，連花清瘟膠囊具有抑菌活性，故進(jìn)行微生物限度檢查時必須首先消除樣品本身上述作用，這樣才能保證被檢微生物正常生長繁殖［2］。表1 顯示，連花清瘟膠囊對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，故分別采用增加稀釋液法、增加培養(yǎng)基體積法及二者聯(lián)合法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。由表2～5 可以看出，稀釋倍數(shù)不同，敏感菌株回收比有顯著差異；當(dāng)供試液中樣品濃度相同時，3 種方法下樣品抑菌活性大致相同；當(dāng)稀釋倍數(shù)為20 倍時，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比均小于0.5，仍具有一定的抑菌性；當(dāng)樣品的稀釋倍數(shù)為50 倍時，兩者回收比均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，表明抑菌性已去除。在控制菌檢查中，用2 種方法、3 個濃度進(jìn)行適用性試驗(yàn)，結(jié)果均檢出陽性菌，表明樣品對控制菌無抑制作用，可用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

研究表明，3 種方法均適用于連花清瘟膠囊微生物限度檢查，但對抗菌活性的去除效果略有不同。表2～5 顯示，當(dāng)供試液稀釋倍數(shù)相同時，去除效果依次為增加培養(yǎng)基體積法＞二者聯(lián)合法＞增加稀釋液法，可能是由于增加培養(yǎng)基體積法注皿時每皿中樣品量最低，從而抗菌活性去除效果最好，各試驗(yàn)菌回收比最高，而且該方法操作簡單，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠［24?27］，與生產(chǎn)企業(yè)前期研究結(jié)果［2，28］一致，適用于連花清瘟膠囊微生物限度檢查。