劉晶晶，何 軼，胡曉茹，戴 忠，馬雙成

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

白癜風(fēng)膠囊收載于2020 年版《中國(guó)藥典》 一部，功效活血行滯、祛風(fēng)解毒，用于治療經(jīng)絡(luò)阻隔、氣血不暢所致的白癜風(fēng)，由補(bǔ)骨脂、紅花、蒺藜、黃芪、川芎、當(dāng)歸、香附、桃仁、丹參、烏梢蛇、紫草、白鮮皮、山藥、干姜、龍膽等15 味藥材組成［1］，但其現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只檢測(cè)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素，難以全面控制質(zhì)量［2］。與傳統(tǒng)HPLC 法相比，UHPLC 法具有靈敏度和分離度更高、分析速度更快等優(yōu)勢(shì)，在中藥質(zhì)量控制種得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［3?4］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC、UHPLC 法分別檢測(cè)白癜風(fēng)膠囊中4?香豆酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)2 種方法所得結(jié)果基本一致，但UHPLC 法分離度、靈敏度更高，分析時(shí)間更短，并且部分成分在UHPLC 下可分離出HPLC 法中未分開(kāi)的雜質(zhì)峰，導(dǎo)致出現(xiàn)一定差異，故兩者不能簡(jiǎn)單互換，而應(yīng)研究建立其方法轉(zhuǎn)移的驗(yàn)證步驟。

1 材料

Waters Acquity Arc 系列液相色譜儀（配置四元低壓梯度泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower3 色譜工作站，美國(guó)Waters 公司）；AE240、XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?300DA 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W、頻率40 kHz）。4?香豆酸（批號(hào)18040301，純度99.3%）、補(bǔ)骨脂素（批號(hào)18040301，純度99.7%）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)18040301，純度99.5%）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（批號(hào)18040301，純度99.4%）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號(hào)18040301，純度99.6%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。XBridge? Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）、XBridge BEH C18XP（2.5 μm，3 mm×150 mm）色譜柱均購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。白癜風(fēng)膠囊購(gòu)自長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司、哈爾濱大洋制藥股份有限公司、天津宏仁堂藥業(yè)有限公司。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［5?7］ 報(bào)道。

2.1.1 UHPLC XBridge BEH C18XP 色譜柱（3 mm×150 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脫（0～2 min，5.0%A；2.0～6.0 min，5.0%～25.0% A；6.0～12.0 min，25.0%～35.0% A；12.0～20.0 min，35.0%～45.0% A；20.0～28.0 min，45.0%～70.0% A；28.0～32.0 min，75.0%～95.0% A；32.0～40.0 min，5.0%A）；體積流量0.6 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 HPLC XBridge? Shield RP18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脫（0～5 min，5.0% A；5.0～15.0 min，5.0%～25.0% A；15.0～30.0 min，25.0%～35.0% A；30.0～50.0 min，35.0%～45.0% A；50.0～70.0 min，45.0%～70.0% A；70.0～80.0 min，75.0%～95.0% A；80.0～90.0 min，5.0% A）；體積流 量1 mL／min；柱 溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分UHPLC、HPLC 色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取4?香豆酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 分別含0.411、0.796、0.838、0.426、1.341 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取研勻后膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密加入25 mL 甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性溶液 按處方比例和制備工藝，制備缺補(bǔ)骨脂、缺紅花的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，依次稀釋至0.5、0.2、0.1、0.04、0.02、0.05、0.01 倍，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。再以S／N≥3 為為檢出限，測(cè)得4?香豆素酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮檢出限（UHPLC／HPLC）分別為3.28×10－6／3.28×10－5、6.37×10－6／6.37×10－5、6.70×10－6／6.70×10－5、3.41×10－6／3.41×10－5、1.073×10－5／1.073×10－4mg／mL；以信噪比S／N ≥10 為定量限，測(cè)得各成分檢出限（UHPLC／HPLC）分別為8.22×10－6／8.22×10－5、1.59×10－5／1.59×10－4、1.68×10－6／1.68×10－5、8.52×10－6／8.52×10－5、2.68×10－5／2.68×10－4mg／mL。

表1 各成分線(xiàn)性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得4?香豆酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮峰面積RSD（UHPLC／HPLC）分別為2.92% ／2.52%、1.59% ／1.26%、1.20% ／1.89%、2.62% ／1.80%、2.91% ／1.78%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取膠囊（批號(hào)6022）適量，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得4?香豆酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮含量RSD（UHPLC／HPLC）分別為1.60% ／3.73%、0.93% ／3.20%、1.02% ／4.67%、2.75% ／3.41%、1.39% ／3.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批膠囊（批號(hào)6022）適量，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得4?香豆素酸、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮峰面積RSD（UHPLC／HPLC）分別為3.41% ／2.07%、2.41% ／1.26%、1.16% ／1.51%、4.34% ／1.94%、1.17% ／0.68%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的膠囊（批號(hào)6022）6 份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL 量瓶中，加入適量對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定 取3 個(gè)廠家生產(chǎn)的膠囊適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3，可知2 種方法所得結(jié)果除補(bǔ)骨脂素外，其他成分含量無(wú)明顯差異。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果

2.9 HPLC?MS 分析 結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂素相應(yīng)色譜峰的HPLC?MS／MS 色譜圖

2.9.1 色譜條件 同“2.1”項(xiàng)。

2.9.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子檢測(cè)模式；載氣氮?dú)猓至鬟M(jìn)樣，分流比4 ∶6；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣N2，體積流量600 L／h；霧化器壓力0.2 MPa；子離子掃描，質(zhì)量范圍m／z100～1 000；母離子m／z443，碎裂電壓50 V，碰撞能量8 eV；母離子m／z187，碎裂電壓25 V，碰撞能量25 eV。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)換方法研究 本實(shí)驗(yàn)對(duì)HPLC、UHPLC 法的轉(zhuǎn)換進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化后方法靈敏度、分離度有提高［8?9］，分析時(shí)間縮短，溶劑消耗減少。2 種方法所得色譜圖的出峰順序和數(shù)量、分離效果、拖尾因子基本一致，但UHPLC 法分離度、理論塔板數(shù)略?xún)?yōu)于HPLC 法；流動(dòng)相、溫度等細(xì)微改變可對(duì)HPLC 法產(chǎn)生影響，但UHPLC 法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間更短［10?12］；除補(bǔ)骨脂素外，其他成分含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。

3.2 轉(zhuǎn)換適用性研究 UHPLC 可將HPLC 色譜峰中的雜質(zhì)分開(kāi)，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不同。圖2 顯示，HPLC 法所得補(bǔ)骨脂素峰分離較好，但由于UHPLC 法分離度更高，可將補(bǔ)骨脂素峰中的雜質(zhì)分離；UHPLC 所得2 個(gè)峰的準(zhǔn)分子離子分別為m／z187、443，而HPLC 色譜圖中兩者均可在補(bǔ)骨脂素色譜峰中檢出，證明它為混合峰。表4 顯示，UHPLC法測(cè)得各成分含量較HPLC 法均偏低，而且比例不同，可能是由于各批次原料差異所致。由于中藥成分復(fù)雜，故在測(cè)定中藥及其復(fù)方制劑中成分含量時(shí)，不應(yīng)簡(jiǎn)單將UHPLC法與HPLC 法轉(zhuǎn)移使用。

參考最新版《美國(guó)藥典》（USP42?NF37）通則（General Chapter）＜621＞相關(guān)規(guī)范，等度洗脫時(shí)可對(duì)HPLC、UHPLC法進(jìn)行轉(zhuǎn)換應(yīng)用，但梯度洗脫時(shí)不允許。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與《美國(guó)藥典》 相符，并且梯度洗脫時(shí)由于分離能力差異，導(dǎo)致HPLC、UHPLC 法峰型、峰數(shù)、各成分含量有所不同。