周 娜，王 進(jìn)，王 蕾，黃 凱，劉 圣

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230038； 2.安徽亞泰天然植物科技有限公司，安徽 金寨237300；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001）

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBlume 的干燥塊莖，立冬后至次年清明前采挖，立即洗凈，蒸透，敞開低溫干燥［1］，主要含有酚類、有機(jī)酸、甾醇、多糖等成分［2?4］，其中天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 等是主要有效物質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗阿爾茲海默病、抗高血壓等作用［5?8］。該藥材種植以安徽、湖北、陜西、云南、貴州等省產(chǎn)量最大，其中安徽以金寨、霍山、岳西為主產(chǎn)區(qū)［9］，但前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，金寨天麻采挖后未及時(shí)加工，而且加工前保存條件及時(shí)間不一，有水煮、硫磺水煮、硫磺熏蒸、自然曬干等方法，導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊［10?11］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化金寨天麻蒸制及干燥工藝，以期為該藥材產(chǎn)地加工提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DHG?9240A 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；HH?S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；MS105DU 型電子分析天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；KS?500VDE／3 型液晶三頻超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材 天麻鮮品于2019 年10 月30 日采自六安市金寨縣長嶺鄉(xiāng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的塊莖。它分為5 個(gè)等級(jí)，即特級(jí)天麻（＞250 g／個(gè)，長度15～17 cm，最大直徑5～6 cm）、一級(jí)天麻（200～250 g／個(gè)，長度15～16 cm，最大直徑4.5～5.5 cm）、二級(jí)天麻（150～200 g／個(gè)，長度13～15 cm，最大直徑4～5 cm）、三級(jí)天麻（100～150 g／個(gè)，長度11～13 cm，最大直徑3～4.5 cm）、四級(jí)天麻（＜100 g／個(gè)，長度9～11 cm，最大直徑2.5～3.5 cm）。

1.3 試劑與藥物 天麻素（批號(hào)110807?201809）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)111970?201702）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A（批號(hào)62499?28?9）、巴利森苷B（批號(hào)174972?79?3）、巴利森苷C（批號(hào)174972?80?6）、巴利森苷E（批號(hào)952068?57?4）對(duì)照品均購自成都普菲德生物科技有限公司。乙腈為色譜純（美國天地公司）；磷酸為色譜純（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（含0.05% 磷酸）（B），梯度洗脫（0～5 min，3% A；5～15 min，3%～10%A；15～18 min，10%～17.5% A；18～35 min，17.5% A；35～45 min，17.5%～25%A；45～45.01 min，25%～3%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長270 nm。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，乙腈?水（3 ∶97）混合溶液溶解定容，即得（天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 質(zhì)量濃度分別為100、30、362.6、101.8、102、102.2 μg／mL）。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（120 W、40 kHz）處理30 min，放冷，稀乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘?jiān)右译?水（3 ∶97）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，乙腈?水（3 ∶97）混合溶液逐級(jí)稀釋2、5、10、20 倍，各取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6 次，測得天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 峰面積RSD 分別為1.15%、1.74%、0.96%、0.87%、1.06%、1.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，于0、6、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定1次，測得天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 峰面積RSD 分別為1.32%、2.18%、2.25%、1.98%、2.21%、1.83%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材粉末約2 g，共6 份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量RSD 分別為2.6%、1.17%、1.43%、1.42%、1.54%、1.39%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末約2 g，共9 份，按照2015 年版《中國藥典》 四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，分別按照80%、100%、120%水平加入對(duì)照品溶液各3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 平均加樣回收率分別 為 96.25%、99.1%、96.41%、99.58%、100.01%、98.91%，RSD 分別為1.26%、1.38%、2.15%、0.96%、2.21%、1.53%。

2.6 鮮品保存方式及時(shí)間考察 種植基地或農(nóng)戶采挖天麻時(shí)，不是采用邊采挖邊蒸制加工的方法，而且通常存放3～6 d 待其全部采挖后集中加工。取當(dāng)天采挖后鮮品若干，一部分于24 h 內(nèi)加工，其余分別于室溫（10～25 ℃）、冷藏柜（2～8 ℃）保存3、6、10 d，洗凈泥沙，取一級(jí)品，普通蒸鍋加水常壓蒸制45 min，切薄片（2 mm），60 ℃烘干至水分不超過12%，粉碎，過三號(hào)篩，HPLC 法測定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量，結(jié)果見表2。

表2 不同保存方式、時(shí)間對(duì)天麻鮮品有效成分含量的影響（n＝3）

由此可知，室溫下藥材采挖后24 h 內(nèi)蒸制或保存3 d后蒸制時(shí)，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量均符合2015 年版《中國藥典》 一部規(guī)定，但相對(duì)于24 h 內(nèi)加工下降38%；巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 總含量相對(duì)于24 h 內(nèi)加工，含量下降45%；室溫條件下保存6 d及6 d 以上時(shí)，天麻出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，故室溫條件下天麻采挖后24 h 內(nèi)蒸制最適宜，如短途運(yùn)輸或來不及加工，則必須于3 d 內(nèi)蒸制加工。另外，冷藏條件下天麻、對(duì)羥基苯甲醇總含量及巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 總含量均呈下降趨勢，而保存6 d 后蒸制時(shí)，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量接近2015 年版《中國藥典》 一部天麻項(xiàng)下不得少于0.25%之規(guī)定，故藥材采挖后以3 d 內(nèi)蒸制為宜，如短途運(yùn)輸或來不及加工，則必須于6 d 內(nèi)完成。

2.7 蒸制時(shí)間考察 取當(dāng)天采挖后天麻鮮品若干，洗凈泥沙，普通蒸鍋加水常壓蒸制，水沸騰至蒸鍋周圍冒圓蒸汽時(shí)計(jì)時(shí)，特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)品蒸制15～60 min，三級(jí)品蒸制10～25 min，四級(jí)品蒸制5～20 min，取出，中間橫切開，游標(biāo)卡尺測量長邊直徑A、短邊直徑B及中心未熟透區(qū)域的長邊直徑a、短邊直徑b，計(jì)算熟透度α，公式為α ＝×100%，各等級(jí)天麻蒸制后切薄片（2 mm），60 ℃烘干至水分不超過12%，粉碎，過3 號(hào)篩，HPLC 法測定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量，結(jié)果見表3。

表3 蒸制時(shí)間、熟透度對(duì)天麻有效成分含量的影響（n＝5）

由此可知，蒸制15 min 后，特級(jí)、一級(jí)品熟透度分別為67.1%、85.5%；蒸制30 min 后，兩者蒸透度均為100%；蒸制45 min 后，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量及巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 總含量均最高，但隨后降低。因此，特級(jí)、一級(jí)品蒸制45 min為宜，二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)品分別蒸制30、20、15 min為宜。

2.8 正交試驗(yàn) 取當(dāng)天采挖后天麻鮮品若干，洗凈泥沙；取特級(jí)、一級(jí)混合品若干，蒸制45 min，取出放涼，選擇干燥溫度（A）、干燥時(shí)間（B）、間歇放置時(shí)間（C）、間歇放置次數(shù)（D）作為影響因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，正交試驗(yàn)優(yōu)化干燥工藝。因素水平見表4。

表4 因素水平

天麻每次烘制前置于熱風(fēng)干燥箱中，排放厚度不超過2 層，先在50～55 ℃下熱風(fēng)干燥3 h，再按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，烘制后粉碎，過3 號(hào)篩，測定水分、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量，結(jié)果見表5，以天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量為指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6；以水分為指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量方差分析

表7 水分方差分析

由此可知，A、B是影響天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量的主要因素，D（間歇放置0 次烘干1 次、間歇放置1 次烘干2 次、間歇放置2 次烘干3 次）是影響水分的主要因素。因此，特級(jí)、一級(jí)品最優(yōu)干燥工藝為A3B2C3D3，即干燥溫度80 ℃，干燥時(shí)間30 h，間歇放置時(shí)間24 h，間歇放置次數(shù)2 次，累積干燥時(shí)間90 h。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 取特級(jí)、一級(jí)混合天麻鮮品3 份，洗凈泥沙，蒸制45 min，取出放涼，按“2.8”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行烘制，粉碎，過三號(hào)篩，測定水分、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量；二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)品分別蒸制30、20、15 min，同法處理，結(jié)果見表8，可知各指標(biāo)均符合2015 年版《中國藥典》 一部相關(guān)規(guī)定。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 天麻采挖后保存方式及時(shí)間確定 天麻鮮品中的酶活性較強(qiáng)、含水量高，并會(huì)侵染各種微生物，如不及時(shí)加工則易出現(xiàn)酶解、腐爛等現(xiàn)象，使有效成分快速降解、藥材品質(zhì)降低［12］。天麻采挖后室溫下24 h 內(nèi)蒸制加工時(shí)，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量最高；室溫下保存3 d 時(shí)，天麻性狀無明顯改變，各有效成分含量下降明顯，但天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量符合2015 年版《中國藥典》 一部天麻項(xiàng)下規(guī)定；室溫新保存6 d 及6 d 以上時(shí)，天麻可出現(xiàn)霉變現(xiàn)象；天麻采挖后冷藏3 d 內(nèi)蒸制加工時(shí)，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量下降不明顯，而冷藏6 d 后蒸制加工時(shí)天麻素、對(duì)羥基苯甲醇總含量符合2015 年版《中國藥典》 一部天麻項(xiàng)下規(guī)定。因此，天麻邊采挖邊蒸制加工或采挖后于室溫24 h 內(nèi)蒸制加工最適宜，若短途運(yùn)輸或來不及加工，則必須于室溫保存3 d 內(nèi)或冷藏6 d 內(nèi)蒸制加工。

3.2 天麻蒸制時(shí)間及方法確定 本實(shí)驗(yàn)中的天麻蒸制加工按照2015 年版《中國藥典》 一部天麻項(xiàng)下采用常壓蒸制工藝，發(fā)現(xiàn)特級(jí)、一級(jí)品以蒸制45 min 為宜，二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)品分別以蒸制30、20、15 min 為宜。田治蛟等［13］報(bào)道，昭通天麻最佳蒸制時(shí)間為特級(jí)35 min，一級(jí)30 min，二級(jí)20 min，三級(jí)15 min，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，但僅考察了天麻素，不夠全面。另外，與蒸制天麻比較，鮮品中對(duì)羥基苯甲醇含量最高，巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量較低，與朱仕豪等［14］研究結(jié)果一致。

3.3 天麻烘干工藝確定 天麻每次烘干前，均先在50～55 ℃下熱風(fēng)干燥3 h，以避免溫度過高時(shí)外層很快干燥形成硬殼，內(nèi)部水分無法排出，出現(xiàn)空心起泡現(xiàn)象。在設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)，干燥溫度越高，天麻素含量越高，而對(duì)羥基苯甲醇含量恰好相反，可能是由于天麻在較高溫度下對(duì)羥基苯甲醇與糖作用生成天麻素［15］，但天麻素、對(duì)羥基苯甲醇與其他有效成分之間的轉(zhuǎn)化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。間歇放置次數(shù)是影響天麻水分的主要因素，2 次時(shí)其含水量最低，前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)種植基地該藥材大多采用曬干、低溫烘房烘干或兩者相結(jié)合的干燥方法，時(shí)間為10～15 d，但在陰雨天氣下易霉變；本實(shí)驗(yàn)采用80 ℃熱風(fēng)電加熱或設(shè)定烘房溫度70～80 ℃，此時(shí)干燥時(shí)間短，干品質(zhì)量穩(wěn)定，適合該藥材種植基地工業(yè)化生產(chǎn)。